代煎中药汤剂微生物限度研究*

安雅婷，杨新建，张善革，付彬，李学林，王雷

(1.天津市中医药研究院附属医院药学部，天津 300120；2.河南中医药大学第一附属医院药学部，郑州 450000)

1 仪器与试药

1.1仪器 YJD20D-GL十功能自动煎药机(北京东华原医疗设备有限责任公司)，YB50-250B中药汤剂包装机(北京东华原医疗设备有限责任公司)，GH802-1A净化工作台(天津市泰斯特仪器有限公司)，HTY-2000B型HTY型集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)，SHP-200B型生化培养箱(天津市天宇实验仪器有限公司)，HHB11420型电热恒温培养箱(天津市实验仪器厂)，MS105DU型万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司，感量：0.1 mg)，AS-3120超声波清洗器(天津市奥特赛恩斯仪器有限公司)，YXQG02型手提式电热压力蒸汽消毒器(山东安得医疗科技有限公司)，量瓶，量筒(F=1.000 0)。

1.2试药 中药饮片均购于安徽省亳州市中药饮片厂，经天津市中医药研究院附属医院长征医院制剂室检验合格；中药汤剂(天津市中医药研究院附属医院煎药室制备，规格：每袋200 mL)；胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：151016)、肠道菌增菌液体培养基(批号：150919)、胰酪大豆胨液体培养基(批号：151028)、麦康凯液体培养基(批号：1511062)、麦康凯琼脂培养基(批号：151026)均由北京三药科技开发公司提供。

2 方法与结果

2.1待测中药汤剂的制备

2.1.1煎煮 按照本院煎药室煎药机煎煮操作规程进行煎煮。一煎加水浸过药面2～5 cm(先行浸泡≥30 min)，煎煮时，先用武火加热达到沸腾，再改用文火慢煎，并保持微沸，煎煮至规定时间(≥30 min)。解表类、清热类、芳香类药物不宜久煎，煮沸后再煎(<30 min)；滋补类药物先用武火煮沸，改用文火慢煎(>30 min)。二煎加水量少于一煎加水量，或根据预期得液量、二煎吸水量及二煎过程中的药液损耗计算加水量。先用武火加热达沸腾，再改用文火煎煮，并保持微沸煎煮至规定时间。一般第二煎煎煮时间比第一煎时间略短(≥20 min)。

2.1.2包装 二煎煎煮完成之后，将二煎药液与一煎药液混合，并使混合后的药液沸腾，采用中药汤剂包装机包装。

2.1.3贮存方式 分别采用冰箱冷藏室(2～8 ℃)储存和室温避光(20±5 ℃)储存，均储存21 d。

2.2制备汤剂所用处方 选择本院制剂室现有质量标准且微生物限度检验方法已经天津市药品检验研究院或区药品检验所验证的32个制剂处方作为研究对象，处方组成见表1。按其功能主治主要分为两类，处方1-23主要具有清热、祛湿等作用；处方24-32主要具有益气、养阴等作用。处方29-30含有非植物类饮片。

表1 32个制剂处方组成

2.3微生物限度检验方法及结果

2.3.1微生物限度检验方法 《中华人民共和国药典》2020年版四部0181合剂项[1]规定，非无菌产品微生物限度(《中华人民共和国药典》2020年版四部 1105，1106，1107)检查：口服给药液体制剂每毫升需氧菌数不得大于200 cfu· mL-1，霉菌和酵母菌数不得大于20 cfu· mL-1，不得检出大肠埃希菌(控制菌)。由于中药煎煮液处方复杂，其成分可能对微生物培养有干扰作用，因此按《中华人民共和国药典》2020年版微生物限度检查法薄膜过滤法[1]进行检测。取各组中药煎煮液2份，充分混匀，立即吸取样品溶液10 mL，加pH值7.0无菌氯化钠蛋白胨溶液稀释至100 mL，得1：10供试液，置涡旋振荡器上充分混匀1 min，静置，取上清液10 mL加入无菌滤筒，用pH值7.0无菌氯化钠蛋白胨溶液冲洗3次，每次100 mL，抽滤。取出滤膜，菌面朝上贴于培养基平板上在培养箱培养；以pH值7.0无菌氯化钠蛋白胨溶液为空白对照，同法检测。另取1：10供试液10 mL，加至胰酪大豆胨液体培养基100 mL进行大肠埃希菌检查；取pH值7.0无菌氯化钠蛋白胨溶液作为空白对照，同法检测。以该处方制成汤剂并包装完成为第0天，分别于第0，1，3，7，14，21天进行性状观察和微生物限度检测。

逃学失败被家中或学校任何一方面发觉时，两方面总得各挨一顿打。在学校得自己把板凳搬到孔夫子牌位前，伏在上面受笞。处罚过后还要对孔夫子牌位作一揖，表示忏悔。有时又常常罚跪至一根香时间。我一面被处罚跪在房中的一隅，一面便记着各种事情，此时想象恰如生了一对翅膀，凭经验飞到各样动人事物上去。按照天气寒暖，想到河中的鳜鱼被钓起离水以后拔刺的情形，想到天上飞满风筝的情形，想到空山中歌呼的黄鹂，想到树木上累累的果实。我应感谢那种处罚，使我无法同自然接近时，给我一个练习想象力的机会。

2.3.2微生物限度检测结果

(1)各组代煎汤剂性状。分别于第0，1，3，7，14，21天，随机抽取“2.1”项每组代煎汤剂各2份，肉眼观察汤剂是否有变色、结块等性状变化。冰箱冷藏室(2～8 ℃)储存和室温避光(20±5 ℃)储存的代煎汤剂从第3天开始，在煎药袋底部逐渐有絮状沉淀出现，含有动物类中药饮片的代煎汤剂(如处方30：炒僵蚕)，与其他汤剂比较沉淀较多，但轻轻摇晃煎药袋，可使之重新混悬，无结块产生，无颜色变化。

(2)各组代煎汤剂微生物限度检验结果。分别于第0，1，3，7，14，21天随机抽取“2.1”项每组代煎汤剂各2份，行微生物限度检验，按照《中华人民共和国药典》2020年版四部0181合剂[1]规定，及非无菌产品微生物限度(《中华人民共和国药典》2020年版四部 1105，1106，1107)检查，进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，及控制菌(大肠埃希菌)检查。结果见表2，3。表2为冰箱冷藏室(2～8 ℃)各组汤剂微生物限度检测结果，表3为室温避光(20±5 ℃)各组汤剂微生物限度检测结果。

表2 冰箱冷藏室(2～8 ℃)各组汤剂微生物限度检测结果

表3 室温避光(20±5 ℃)各组汤剂微生物限度检测结果

随储存时间延长，在两种贮藏条件下，各组代煎汤剂均未检出控制菌。置于冰箱冷藏室(2～8 ℃)的代煎汤剂在随机抽检的第0，1，3，7天均未检测出需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌。在随机抽检第14天，有18组代煎汤剂检出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有29组代煎汤剂检出霉菌和酵母菌，含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范围内。在随机抽检第21天，有28组代煎汤剂检出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有30组代煎汤剂检出霉菌和酵母菌，含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范围内。随着储存时间延长，冰箱冷藏室(2～8 ℃)储存的代煎汤剂，第21天抽检样品中检出需氧菌数、霉菌和酵母菌数均高于第14天的抽检样品，差异有统计学意义(P<0.01)。室温避光(20±5 ℃)储存的代煎汤剂在随机抽检第0，1，3天均未检测出需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌。随机抽检第7天，有7组代煎汤剂检出霉菌和酵母菌含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范围内。在随机抽检第14天有29组代煎汤剂检出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有28组代煎汤剂检出霉菌和酵母菌，含量≤20 cfu·mL-1，均在合格范围内。在随机抽检的第21天，有29组代煎汤剂检出需氧菌，含量≤200 cfu·mL-1；有32组代煎汤剂检出霉菌和酵母菌，其中27组含量≤20 cfu·mL-1，在合格范围内；有5组霉菌和酵母菌含量>20 cfu·mL-1，微生物限度不合格。

①两类汤剂间微生物限度比较：对清热类汤剂和补益类汤剂的微生物进行比较，采用SPSS22版软件，运行独立样本t检验，均P>0.05，两类代煎汤剂微生物数量差异无统计学意义。

②相同取样时间，不同贮藏条件比较：采用SPSS 22版软件，运行配对样本t检验。第14，21天，室温避光(20±5 ℃)储存代煎汤剂中产生的需氧菌数量高于冰箱冷藏室(2～8 ℃)储存样品，均差异有统计学意义(P<0.05)。第14天，室温避光(20±5 ℃)储存代煎汤剂中的霉菌和酵母菌数量高于冰箱冷藏室(2～8 ℃)储存样品，但差异无统计学意义(P>0.05)。第21天，室温避光(20±5 ℃)储存代煎汤剂的霉菌和酵母菌数量高于冰箱冷藏室(2～8 ℃)储存样品，差异有统计学意义(P<0.01)。

③相同贮藏条件，不同取样时间下比较：采用SPSS 22版软件，运行配对样本t检验。冰箱冷藏室(2～8 ℃)储存代煎汤剂，第21天抽检样品中检出需氧菌数、霉菌和酵母菌数均高于第14天抽检样品，差异有统计学意义(P<0.01)。室温避光(20±5 ℃)储存代煎汤剂，第21天抽检样品中检出需氧菌数、霉菌和酵母菌数均高于第14天抽检样品，霉菌和酵母菌数差异有统计学意义(P<0.01)；需氧菌数差异无统计学意义(P>0.05)。

整体看，随着时间延长，各组代煎汤剂微生物有随之增长趋势，但各组代煎汤剂本身并无明显规律。

3 讨论

中药汤剂在我国至今已有数千年应用历史，现代中药汤剂质量研究主要集中于煎煮过程控制对其成品煎液得量、密度、某些指标性成分含量的影响方面。在对汤剂成品质量的考察方面，随着现代分析技术的发展，从考察处方中某些单一成分定量分析，到对中药配方颗粒、经典方汤剂、中成药多成分、多靶点全面控制。但由于代煎中药汤剂多为临床医生根据患者病情开具，一人一方，因此对代煎中药汤剂的质量控制研究困难重重。由于煎药机及煎药中心的发展，以及煎煮方法和器具使用等的诸多限制，患者多选择代煎，中药汤剂作为一种药学延伸服务，应该有其相应的质量控制标准。已有研究表明，煎药室通风情况良好可减少交叉污染，操作环境干净整洁可减少次生污染，保障煎药设备、用具、洁具等的清洁到位可减少交叉污染或次生污染，尽量减少包装材料材质、储藏和使用过程中引入污染，以及操作人员严格按照操作规程执行，都会对代煎中药汤剂微生物限度产生影响[2]。而2020年版《中华人民共和国药典》编制过程中，虽然对中药饮片进行微生物限度检验征求过意见，但由于实际情况所限，并未收载需煎煮饮片的微生物限度标准。本研究依托国家重点研发计划项目“中药饮片智能调剂与煎煮设备关键技术研究”，建立“中药汤剂煎煮技术规范”，从同质煎药流程及方法、提高代煎汤剂质量、保护患者健康、降低用药风险等方面入手，对代煎中药汤剂微生物限度进行研究。

由于临床中药处方组方复杂多变，中药汤剂成分复杂，且其中某些成分具有抑菌作用，如中药清热药多含有绿原酸、小檗碱等抑菌成分，会影响微生物限度检查准确性。因此，本研究采用天津市中医药研究院附属医院制剂室已经过微生物限度验证的中药制剂处方，处方均已收录于2016年版《天津市医疗机构制剂规范》[3]，按照该院煎药室的标准操作规程进行操作，且煎药室定期进行环境及设备微生物监测，考察代煎中药汤剂在不同贮藏时间、温度下微生物变化情况。

古代由于条件所限，汤剂的煎煮及贮藏与现代不尽相同，如古代无冰箱等控温冷藏设备，汤剂多可能当天煎煮、当天服用，而现代代煎中药汤剂由于其包装密封性能良好，多可能将7或14 d汤剂冷藏于冰箱内或阴凉通风处。因此，本研究选择贮藏方式及温度分别为冰箱冷藏室(2～8 ℃)储存和室温避光(20±5 ℃)储存；考察的时间点选择第0，1，3，7，14，21天，进行微生物限度检测，所监测的温度及时间覆盖一般代煎中药汤剂的贮藏期限。

《中华人民共和国药典》2020年版四部0181合剂项下定义，合剂系指饮片用水或其他溶剂，采用适宜的方法提取制成的口服液体制剂[1]，与汤剂制备符合，因此本研究选择合剂项下微生物限度检验作为标准。研究结果显示，在经过微生物检验的煎药环境下，采用密封包装的代煎中药汤剂，无论其在冰箱冷藏室(2～8 ℃)储存或室温避光(20±5 ℃)储存，在14 d内其微生物限度均符合《中华人民共和国药典》2020年版合剂项下微生物限度的要求；但随储存时间的延长，其微生物数量呈逐渐增多趋势，但每个具体处方微生物数量趋势，并无明显规律，可能与各处方所含不同饮片和每味饮片在其处方中的比例不同有关，需在后续实验中具体考察单独处方的微生物限度变化规律。

综上所述，由于临床开具处方丰富多样，各家中药汤剂代煎机构煎煮设备、包装设备、操作和储存的环境不同，代煎中药汤剂微生物限度有很多影响因素。对影响代煎中药汤剂质量的相关因素进行全面控制，能更好地保证代煎中药汤剂质量稳定。本研究由于条件所限，只考察了已有微生物限度检验方法的中药汤剂，且在操作和环境可控条件下，密封包装的代煎中药汤剂的微生物限度，低温、避光的贮藏条件，更有利于减少代煎中药汤剂的微生物滋生，保证患者用药安全。单味饮片煎剂的微生物限度研究、非密封包装对汤剂微生物限度的影响等，在后续研究中会逐步纳入。开展代煎中药汤剂微生物限度监测的研究，对提高中药汤剂的质量、患者用药安全和疗效具有重要意义。