油茶树嫩枝精油抗氧化性及抑菌性研究

张玉龙，张伟，敬思群，吴飞虎

1.韶关市友丰生态园林开发有限公司（韶关 512005）；2.韶关学院英东食品学院（韶关 512005）；3.新疆大学生命科学与技术学院（新疆 830046）

植物精油具有天然、安全、绿色、环保等优势，其应用领域逐渐渗透到食品、制药、康养等领域。植物精油有解热止痛、安眠、杀菌消炎[1]、降三高[2]、防止癌症和肿瘤[3]、增强免疫功能[4]、延缓衰老[5]、生物保鲜[6]等功效。对精油抑菌活性、抗氧化生物活性的研究一直是近年来研究热点[6-11]。

油茶（Camellia oleifera），又名茶籽树，是中国重要的木本油料树种。通常在种植油茶树的时候，剪枝是增加产量的一个重要方法，在春季的油茶树剪枝，就是直接避免生长素的分泌，使得结果开花率增加，即直接将尖端的嫩枝全部剪掉，再减掉很多小枝，增加横向吸收阳光的面积的覆盖率，提高结果的数量，因此会有一定量的油茶嫩枝被丢弃。油茶树嫩枝精油又名刀烟，龙正海等[12]研究发现，其具有用于治疗刀伤、烫伤、烧伤、急性炎症、皮肤癌等的作用。关于油茶树的研究主要集中于油茶籽绿色加工技术[13]、油茶籽油提取技术研究[14-15]、油茶籽油成分及品质分析[16-18]、油茶籽油理化性质及功效研究[19-20]，而鲜见油茶树嫩枝精油的研究。

油茶树是粤北地区特色经济植物，韶关重点发展农作物之一，位于韶关的广东友丰油茶科技有限公司拥有3万亩油茶树园。针对大量油茶嫩枝尚未开发利用的现状，采用水蒸汽蒸馏法提取油茶树嫩枝精油，利用气相色谱-智谱联用（GC-MS）分析油茶树嫩枝精油组成成分，通过体外抗氧化模型 DPPH·自由基、ABTS+·自由基、总抗氧化能力评价精油的抗氧化活性，采用滤纸片法进行抑菌试验，分析抑菌圈，测定最低抑菌浓度（MIC）。在为丢弃油茶嫩枝资源开发利用提供科学依据的同时，也将变废为宝，具有一定生态效益，并推动韶关乃至粤北地区油茶产业链发展。

1 材料与方法

1.1 主要材料试剂和仪器

油茶树嫩枝（采集于广东友丰油茶科技有限公司油茶基地，采摘后进行清洗置于65 ℃干燥2 h，剪碎至1 cm左右，真空包装待用）。

大肠杆菌（Escherichia coli，革兰阴性菌G-）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，革兰氏阳性菌G+）、酵母菌（Yeast）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus）（韶关学院英东生物与农业学院微生物实验室）。

酵母浸膏、牛肉浸膏（上海展云化工有限公司）；琼脂粉（北京奥博星生物技）；蛋白胨（南京茂捷生物科技有限公司）；抗坏血酸（纯度99%，上海源叶生物科技有限公司）；维生素E（纯度99%，浙江医药有限公司）；TBHQ（食品级，上海染料研究所有限公司）；1.1-二苯基-2-苦基肼（C18H12N5O6，分析纯，梯希爱上海化成工业发展有限公司）；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（分析纯，上海源叶生物科技有限公司）。

GT洁净工作台吴江和希净化科技有限公司；Al-104电子天平（北京金科利达电子科技有限公司）；SHE-3000G酶标仪（北京赛尔福知心科技有限公司）；SPX-250BⅢ生化培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪（日本岛津公司）。

1.2 水蒸气蒸馏法提取精油

油茶树嫩枝精油地提取参考刘晓丽等[21]中水蒸气蒸馏法，稍作改进：称取一定量剪碎的油茶树嫩枝放入蒸馏烧瓶中，蒸馏水与NaCl加入比例10∶1，加热蒸馏，待提取器中油量不再增加时，停止加热，冷却后收集精油。

精油提取率计算如式（1）。

式中：E为精油提取率，%；m为油茶树嫩枝精油质量，g；M为油茶树嫩枝质量，g。

1.3 油茶树嫩枝精油成分气质联用（GC-MS）分析

1.3.1 甲酯化处理

吸取0.3 mL油茶树嫩枝精油于试管中，加入0.5 mL石油醚与乙醚（4∶3，V/V）混合溶液，加入0.5 moL/L氢氧化钾-甲醇溶液0.4 mL，振荡，静置10～15 min。加入蒸馏水，静置分层，取上清液进样分析。

1.3.2 GC条件

色谱柱DB-5毛细管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）。程序升温：初始温度40 ℃，保持3 min，程序升温10 ℃/min，升温至210 ℃，保持2 min，程序升温5 ℃/min，升温至280 ℃，保持3 min。进样口温度280℃、柱前压43 kPa、载气氮气、进样量0.5 μL、分流比20∶1，载气流速1 mL/min。

1.3.3 MS条件

EI离子源，源温200 ℃、电子能量70 eV、连接器温度须230 ℃、质量扫描范围（m/z）30～500。按峰面积归一化法计算各组分相去对百分含量。

1.4 油茶树嫩枝精油抗氧化性分析

1.4.1 抗坏血酸标品、维生素E标品、TBHQ标品溶液配制

分别用电子天平精密称取样品10 mg，用水溶解于100 mL容量瓶中定容至100 mL（溶液为100 μg/mL），精密取上述用水稀释配制系列质量浓度4，8，12，16和20 μg/mL，用无水乙醇分别装配质量浓度为4，8，12，16和20 μg/mL的油茶树嫩枝精油，待用。以IC50值比较抗氧化能力，IC50值表示清除率为50%时，抗氧化剂的浓度，IC50值越小，抗氧化能力越强。

1.4.2 DPPH·自由基清除能力分析

参考刘艳灿等[22]的作法略做改进。以1.0 mL样本溶液与1.0 mL浓度0.1 mmol/L DPPH·溶液，混合均匀后暗处放置30 min，无水乙醇作为参比溶液，在517 nm处测定其吸光度A，同时测定1.0 mL样品溶液与1.0 mL无水乙醇混合后在517 nm处的吸光度A0，测定1.0 mL DPPH·溶液与1.0 mL无水乙醇混合液在517 nm处的吸光度A1，所有测定平行进行3次取平均值，按式（2）计算其清除率。

1.4.3 ABTS+·自由基清除能力分析

参照FAN ZL等[23]方法。ABTS+·工作液配制，取5.2 mmol/L过硫酸钾溶液10 mL与7.4 mmol/L ABTS+·溶液20 mL进行混合，室温、避光条件下放置12 h后，用无水乙醇稀释40～50倍（A734nm=0.7±0.02），得ABTS+·工作液。将0.2 mL不同浓度样品加入0.8 mL ABTS+工作液中，6 min后，于736 nm波长测定吸光度A。同时测定0.2 mL样品溶液与0.8 mL无水乙醇混合液在736 nm处的吸光度A0，测定0.2 mL无水乙醇与0.8 mL ABTS+·工作液混合液在517 nm处的吸光度A1，所有测定平行进行3次取平均值，按式（3）计算其清除率。

1.4.4 总还原力测定

利用普鲁士蓝法测定来油茶树嫩枝精油的还原能力。参照Jing等[24]方法并略做修改，取1 mL样品溶液加入到装有2.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/mL，pH=6.6）的具塞试管中，再加入2.5 mL 1%铁氰化钾溶液混合均匀，于50 ℃恒温水浴反应20 min，快速冷却后，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应，以4000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL水，0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀后静置10 min，在700 nm下测吸光度（As），所有测定平行进行3次，取平均值。根据式（4）计算吸光度

式中：A为总抗氧化能力；As为样品吸光度；A0为空白对照。

1.5 油茶树嫩枝精油抑菌试验

1.5.1 抑菌圈测定采用滤纸片法[24]

以生理盐水作阴性对照，用0.2%山梨酸钾溶液作阳性对照。真菌培养皿放在28 ℃下培养48 h后进行观察记录，细菌培养皿放在37 ℃下培养24 h后进行观察记录。测量其抑菌圈的大小，根据抑菌圈的大小[29]判断活性的强弱抑菌圈大，则表明其活性强，抑菌圈小则表明其活性弱。

1.5.2 最小抑菌浓度（MIC）测定

将油茶树嫩枝精油用95%乙醇分别配成含精油添加量1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%和8%溶液，取滤纸片（直径6 mm，已灭菌）浸没于上述配制的样品溶液中，使其充分混匀，接于制作好的含菌培养皿中，每个组分对测试菌种分别做2个重复，并以液态营养琼脂作为空白对照。将制好后的真菌培养皿在28℃恒温培养48 h后观察而细菌培养皿在37 ℃恒温培养24 h后观察，测量其抑菌圈的大小，以最先出现抑菌圈的浓度为最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 油茶树嫩枝精油成分组成

由表1可知，以峰面积归一化法分析各个组分的相对含量，从水蒸气蒸馏提取的油茶树嫩枝精油中鉴定出11种化合物，其中反-9-十八碳烯酸甲酯、棕榈酸甲酯、α-萜品醇、芳樟醇相对含量比较高，分别为33.01%，23.13%，14.18%和12.13%。这与龙正海等[2]的报道一致，但相对含量有差异，是由于油茶树种植地区不同而致。

图1 油茶嫩枝精油组成的TIC图

表1 油茶树嫩枝精油（水蒸气蒸馏）GC-MS分析结果

2.2 油茶树嫩枝精油抗氧化性

2.2.1 油茶树嫩枝精油清除DPPH·自由基能力

由图2A可知，油茶树嫩枝精油具有一定清除DPPH·自由基能力，精油质量浓度20 μg/mL时，对DPPH·自由基清除能力达到58%，且呈剂量效应关系。油茶树嫩枝精油、抗坏血酸（VC）、维生素E、TBHQ对DPPH·自由基的IC50值分别为18.03±5.05 μg/mL、6.755±1.653 μg/mL、8.593±2.247 μg/mL、5.027±3.159 μg/mL；由图2B可知，油茶树嫩枝精油对ABTS+·自由基具有良好清除能力，在精油浓度20 μg/mL时，对ABTS+·自由基的清除能力达到67%，且呈剂量效应关系。油茶树嫩枝精油、抗坏血酸（VC）、维生素E、TBHQ对ABTS+·自由基的IC50值分别为10.19±7.409 μg/mL、4.709±2.955 μg/mL、5.678±2.369 μg/mL、5.729±4.406 μg/mL；由图2C可看出，油茶树嫩枝精油的总抗氧化能力随着质量浓度增大而增大，与质量浓度呈正相关关系。质量浓度20 μg/mL时，油茶树嫩枝精油、抗坏血酸（VC）、维生素E、TBHQ的吸光度值分别为0.291，1.800，1.722和1.719，吸光度越大，其抗氧化能力越强，所以相对于阳性对照，精油的总抗氧化能力较弱。

图2 油茶树嫩枝精油抗氧化能力

2.3 油茶树嫩枝精油抑菌性

2.3.1 抑菌圈分析

由表2可以看出，油茶树嫩枝精油对所试菌均有抑制作用，以对细菌的抑制作用较强，对革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）、革兰阴性菌（大肠杆菌）都有较好的抑制作，其次是酵母菌，对霉菌抑制作用最弱。

表2 油茶树嫩枝精油的抑菌作用

2.3.2 油茶树嫩枝精油对细菌，真菌和霉菌的最低抑菌浓度

由表3可通过看出油茶树嫩枝精油对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）值为4%，对金黄色葡萄球菌的MIC值为5%，对革兰阴性菌的抑菌效果优于革兰阳性菌。油茶树嫩枝精油对酵母菌的MIC值为6%，而对黑曲霉与根霉的MIC值为8%，说明油茶树嫩枝精油对细菌的抑制作用要强于对真菌与霉菌的，且对大肠杆菌抑制效果最强。

表3 油茶树嫩枝精油的最小抑菌浓度试验结果

2.3.3 分析比较

将油茶树嫩枝精油的抑菌性与肉桂精油通过及黄花忍冬果精油抑菌性做比较，见表4。

由表4抑菌圈直径可以看出，油茶树嫩枝精油对细菌的抑菌作用强于黄花忍冬果精油，但弱于肉桂精油去对细菌的抑菌性，相去对来说是一种抑菌效果较好的广谱抑菌剂；从最小抑菌浓度来看，油茶树嫩枝精油对细菌、霉菌的最小抑菌浓度均比黄花忍冬果精油小，但比肉桂精油略大。

表4 3种精油的抑菌效果比较分析

3 结论

水蒸气蒸馏法提取油茶树嫩枝精油的提取率为0.045%；油茶树嫩枝精油经GC-MS分析，从水蒸气蒸馏提取的油茶树嫩枝精油中鉴定出11种化合物，其中反-9-十八碳烯酸甲酯、棕榈酸甲酯、α-萜品醇、芳樟醇相去对含量比较高，分别为33.01%，23.13%，14.18%和12.13%。

油茶树嫩枝精油具有良好的体外抗氧化能力，可作为一种新型的天然的抗氧化剂。油茶树嫩枝精油、抗坏血酸（VC）、维生素E、TBHQ对DPPH·自由基清除能力IC50值分别为18.03±5.05 μg/mL、6.755±1.653 μg/mL、8.593±2.247 μg/mL、5.027±3.159 μg/mL，对ABTS+·自由基清除能力IC50值分别为10.19±7.409 μg/mL、4.709±2.955 μg/mL、5.678±2.369 μg/mL、5.729±4.406 μg/mL，并呈剂量关系；油茶树嫩枝精油总抗氧化能力与质量浓度呈正相关，质量浓度20 μg/mL油茶树嫩枝精油、抗坏血酸、维生素TBHQ的总抗氧化能力用吸光度表示分别为0.291，1.800，1.722和1.719。油茶树嫩枝精油具有一定抗氧化活性。

油茶树嫩枝精油对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌，根霉和黑曲霉均有抑制作用。油茶树嫩枝精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、根霉及黑曲霉的抑菌圈分别为14.1±0.2 mm、11.1±0.1 mm、9.7±0.5 mm、6.4±0.5 mm、6.6±0.4 mm；对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）值为4%，对金黄色葡萄球菌，根霉，酵母菌和黑曲霉的MIC值分别为5%，8%，6%和8%。油茶树嫩枝精油对大肠杆菌的抑制作用最强。