金银花中绿原酸的积累和生物合成研究进展

徐萍 ，徐小博，郭晖，许平辉，李凤梅，TATIANA Fotina

1.新乡学院生命科学与基础医学学院（新乡 453003）；2.新乡博凯生物技术有限公司（新乡 453300）；3.兽医学院苏梅国立农业大学（苏梅 40021）

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicerae JaponicaeThunb）的干燥花蕾或带初开的花，味甘，性寒，具有清热解毒、疏散风热之功效[1-2]。金银花种植已有1000多年的历史，以河南、山东为主产区，且河南产地的品质佳[3]。金银花中的标志性成分是绿原酸和木犀草苷[1]。绿原酸（chlorogenic acid，CGA）属于苯丙素类化合物[4]，其对生物体的生理作用主要表现在清除体内活性氧自由基以及抗氧化作用[5]。基因型、产地、栽培管理方式等都会影响金银花中绿原酸的含量。随着新一代测序的发展，CGA的生物合成途径研究越来越深入，这将有助于通过基因工程方法来提高内源的绿原酸含量。

近年来对金银花中绿源酸的生物合成研究取得了很多进展。综述了近年影响金银花中绿原酸含量的因素、绿原酸生物合成途径及其调控方面的最新研究成果，以期为绿原酸的生物合成及调控研究提供理论参考。

1 金银花中绿原酸的积累规律

1.1 产地对金银花中绿原酸含量的影响

产地的自然环境对金银花品质的形成十分重要，不同产地金银花的有效成分绿原酸、木犀草苷含量有明显的差异[6]。张重义等[7]比较了不同产地中药材金银花的质量，结果发现不同的地理环境，由于土壤、光照强度、光照时间等因素的影响造成绿原酸含量的差异。因此，强调药材的道地性是有道理的。

1.2 基因型差异对金银花中绿原酸含量的影响

目前栽种的金银花优良品种有“金丰一号”“九丰一号”“中金一号”“四季树型”“北花1号”。栽培品种的绿原酸含量都能达到中华人民共和国药典（2020）要求，但品种间存在差异。林慧彬等[8]对10个金银花品种的质量分析表明，金银花种质之间绿原酸含量差异明显，10个金银花种质样品绿原酸含量均符合药典规定。绿原酸的含量在1.94%～4.00%之间，其中“亚特”良种金银花、“亚特立本”金银花、“山东平邑”金银花及“九丰一号”金银花绿原酸含量较高。

1.3 不同生长时期金银花中绿原酸含量变化

采收期是影响金银花中绿原酸、木犀草苷含量最重要的因素之一。不同采收期金银花的绿原酸含量和产量存在差异[9-11]。李建军等[12]研究表明金银花不同花期绿原酸含量为0.350%～2.501%，二白期最高，其次为三青期和大白期，凋花期最低。莫爱琼等[13]研究了华南忍冬不同发育阶段花超微结构及其绿原酸积累规律，结果发现在花冠筒中，幼蕾期和绿蕾期绿原酸含量丰富；白蕾期薄壁细胞内绿原酸含量开始减少，维管束仍积累较多的绿原酸；银花期和金花期薄壁细胞绿原酸含量进一步减少且分散分布，维管束累积的绿原酸也减少，主要分布在木射线中。在花萼筒—子房中，不同发育阶段，其薄壁细胞、维管束、中轴胎座和胚珠都有绿原酸分布。表明绿原酸可能在叶绿体内合成，然后转至细胞液中聚合，最后在液泡内积累；叶绿体中淀粉粒数量与绿原酸合成呈负相关。

2 金银花中绿原酸的生物合成途径及相关酶

2.1 金银花中绿原酸的生物合成途径

绿原酸是植物中的葡萄糖经莽草酸途径产生的。葡萄糖经过相关酶的催化转化成莽草酸，再由莽草酸转化成苯丙氨酸，在苯基丙氨酸转氨酶（phenylalanin ammonia-lyase，PAL）作用下生成肉桂酸，肉桂酸再在肉桂酸羟化酶作用下生成香豆酸，继而在香豆酰辅酶连接酶（4-coumarate：coenzyme a ligase，4CL）作用下生成香豆酰辅酶A[14-15]。香豆酰辅酶A继续生成绿原酸CGA的生途径存在三个路线（图1），目前仍存在争论。已提出的三种生物合成途径是：第一种途径为由羟基肉桂酰-CoA奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（hydroxycinnamoyl CoA transferase，HQT）催化奎尼酸和咖啡酰CoA生成。第二种途径表明CGA来自奎尼酸和咖啡酰-D-葡萄糖，并由羟基肉桂酰基葡萄糖催化：奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT）。第三种途径提出CGA来自对香豆酰奎尼酸，并由羟基肉桂酰CoA莽草酸/喹啉羟基肉桂酰转移酶催化[16-17]。

图1 植物中绿原酸的生物合成途径

2.2 绿原酸生物合成途径的相关酶

2.2.1 苯丙氨酸酶（PAL）

PAL是苯丙烷类化合物合成途径中的一个关键酶。关键酶基因大都是以基因家族的形式存在，秦双双等[18]分别检测了华南忍冬PAL1，PAL2，PAL3基因在花蕾和叶中的表达水平，PAL3在花蕾中的表达水平要高于叶，推测华南忍冬PAL3基因可能与绿原酸成分积累有关。但金银花中的PAL基因的全长序列尚未见报道。

2.2.2 4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）

最近，基于转录组学研究，已在A.thaliana和Oryza sativa中表征了许多4CL。Yuan等[19-21]预测了LJ4CL1的功能，获得了粗LJ4CL1蛋白，4-香豆酸是LJ4CL1的底物之一，并基于表达数据、蛋白质结构分析和底物表征，提出LJ4CL功能与金银花中绿原酸等化合物的合成有关。

2.2.3 香豆酸-3-羟化酶（C3H）

C3H是一种编码香豆酸-3-羟化酶的基因，参与绿原酸生物合成的酶。Pu等[22]分离和鉴定LjC3H基因（登录号：KC765076），序列全长为2114 bp，其中包含1533 bp的开放阅读框，296 bp的5’非翻译区，285 bp[包括18个核苷酸的poly（A）尾]和3’非翻译区。系统发育分析表明该蛋白属于CYP98A亚家族，同源模型显示其结构类似于其他细胞色素P450家族蛋白[23]。Southern印迹分析表明，在Lonicera japonica基因组中存在多于一个与LjC3H同源的序列。LjC3H cDNA在大肠杆菌中的异源表达体外测定试验揭示该酶有利于对香豆酰基莽草酸作为底物的对香豆酰基喹啉。进一步研究发现茉莉酸甲酯处理和暴露于UV-B辐射处理均能上调LjC3H的转录。金银花叶片中的绿原酸含量水平与LjC3H转录本丰度呈正相关。随后，亓希武等[24]克隆得到一个与LjC3H同源的基因，命名为LjC3H2（登录号：KX845342）。该同源基因编码框全长1521 bp，编码506个氨基酸残基，理论等电点为8.92，理论分子质量为57.4 kDa。蒋向辉[25]将LjC3H的5’-RACE和3’-RACE扩增产物序列在Genedoc软件中进行拼接，也得到一条LjC3H基因的全长序列（登录号：JX272843）。

2.2.4 羟基肉桂酰-CoA莽草酸/喹啉羟基肉桂酰转移酶（HCT）

莽草酸/奎宁酸香豆酰转移酶（HCT）是金银花中绿原酸合成途径的关键酶。Liu等[26]首次在L.japonica中发现HCT基因。研究发现LjHCT1和Cynara cardunculusvar.scolymus是最相似的，相似度为83%。蒋向辉[25]将LjHCT的5’-RACE和3’-RACE扩增产物序列在Genedoc软件中，拼接得到LjC3H1基因的全长序列（登录号JX424844）。何柳等[27]通过cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得8条可能的HCT基因cDNA全长序列。其中1个基因为金银花 HCT（LjHCT）基因，该基因全长1275 bp，蛋白质分子质量约为47 kDa，进化关系表明LjHCT与咖啡（Coffea arabica）中HCT氨基酸序列相似度达到86%。

2.2.5 羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶（HQT）

羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶（HQT）是金银花绿原酸合成过程中的另一个关键酶。Zhang等[28]通过利用农杆菌介导的转化获得了用HQT转化的金银花愈伤组织，构建HQT真核表达载体，证实了HQT基因表达可以调控金银花中绿原酸的含量。Peng等[17]从L.japonica中分离出编码439个氨基酸的蛋白质的羟基肉桂酰-CoA奎宁羟基肉桂酰转移酶（HQT）基因（登录号：GQ847546），RT-PCR结果显示HQT的组织分布与CGA含量的模式一致。骆鹰等[29]对金银花HQT基因（Lonicera japonicaAIG20957.1）氨基酸序列与其他植物间相应片段进行同源比对和系统进化分析，并对该基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、二级结构和三级结构等方面进行了预测和分析。LjHQT编码的蛋白含424个氨基酸，是一种亲水性蛋白，LjHQT可能定位于叶绿体或其他细胞器；其编码的氨基酸序列与中果咖啡（Coffea canephora）的同源关系较近。张静茹等[30]进一步研究发现，金银花愈伤组织中绿原酸的量随HQT基因表达量的升高而升高，说明其对绿原酸的生物合成有调控作用。在忍冬科其他植物中也证明HQT基因与绿原酸产量密切相关[31]，陈泽雄[32]从灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz）中克隆出了Lm HQT1基因。

3 绿原酸生物合成途径的调节

3.1 金银花中的转录因子

转录因子（transcription factor，TF）是重要的DNA结合蛋白。TF影响RNA聚合酶对基因启动子的接近，并通过与转录机制的其他组分相互作用在基因转录的调节过程中发挥重要作用。目前在金银花中调控绿原酸生物合成的转录因子有碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，b ZIP）蛋白和MYB转录因子。

3.1.1 碱性亮氨酸拉链（b ZIP）蛋白

碱性亮氨酸拉链蛋白是真核生物的转录因子和阻抑蛋白中最大而且最保守的类型之一，因其含有b ZIP结构域而命名。b ZIP结构域由60～80个氨基酸组成，包含一个基础区域和一个亮氨酸拉链。近年来，越来越多的b ZIP转录因子功能被揭示，研究发现其参与植物多个中心调控和生理过程。Zha等[33]首次研究了金银花中b ZIP家族的功能和表达，分别从金银花（Lonicera japonica）和红白忍冬（Lonicera japonicavar.chinensis）中获得11个LjbZIP 蛋白和24个rLjbZIP蛋白，均含有b ZIP保守域，11个LjbZIP的序列登录号为KT218625-KT218635。进一步研究发现只有LjbZIP8可以特异性地结合到LjPAL2启动的 G-box上，亚细胞定位和电泳迁移率变动分析显示转录因子LjbZIP8是核定位蛋白。生物信息学分析揭示 LjbZIP8包含432 bp编码144氨基酸的ORF区，预测的保守结构域显示LjbZIP8属于具有N末端富含脯氨酸的结构域的bZIP GBF1亚家族。

3.1.2 MYB转录因子

MYB家族转录因子广泛存在于真核生物中，其中一些MYB家族成员可通过调控靶基因的表达来调控植物体内次生代谢物质的合成。Zhang等[34]发现，与花相比，叶中的MYB家族的ein3和gbf1上调，nap下调。Ein3及其最接近的同系物eil1是ein2下游的两个主要转录因子，对诱导多个乙烯反应基因具有非常重要作用[35]。Zhang等[34]研究分析显示ein3与eil1和ap2相互作用。eil1和ap2都与乙烯介导的信号传导途径相关联。由此推断ein3，eil1和ap2可能形成复杂的基因网络，以调节金银花叶片衰老过程。此外还发现ein3在花中下调，表明在L.japonica的花衰老调控过程中存在不同的信号途径。同时花中的绿原酸含量高于叶中的，这与转录因子的调节一致，暗示MYB转录因子对绿原酸合成调控具有重要意义。Zhang等[34]通过进一步的研究还发现了金银花中的其他MYB转录因子，如C2H2和ERF等。Qi等[36]从金银花中分离了R2R3-MYB转录因子基因LjaMYB12，在拟南芥中异位表达LjaMYB12可以增加PAL活性，表明LjaMYB12具有调节绿源酸生物合成的可能。在茄科作物中研究发现，拟南芥转录因子AtMYB11、AtMYB12转入植物体后，多酚类物质合成途径与多个相关合成基因的上调表达有关，绿原酸的含量也增加[37]。

3.2 DNA甲基化对绿原酸生物合成的影响

Zha等[33]研究发现用5-氮杂胞苷处理降低了金银花叶片中LjPAL2的转录水平和CGA的含量。DNA甲基化可能通过影响转录因子LjbZIP的募集，从而调节L.japonica中PAL2表达水平和CGA含量。植物碱性亮氨酸拉链蛋白在高等植物基因表达与调控中起重要作用。

3.3 其他因素对绿原酸生物合成的影响

研究发现外源物质、内生菌和植物病害也会影响绿原酸生物合成途径。朱艳霞等[38]通过喷施GA3能够显著提高金银花内源激素GA3水平，显著提高C4H1，C4H2，4CL1，HQT2基因表达量，显著提高活性成分绿原酸和咖啡酸的含量。周芸帆等[39]发现忍冬枝枯病可以通过影响苯丙素生物合成途径中桂皮酸途径相关酶基因Lj HQT和Lj C4H2的转录水平来影响金银花中绿原酸的合成。唐明[40]研究表明，6种内生菌均不同程度地影响着‘渝蕾1号’悬浮体系生物量的含量和绿原酸的积累。

4 结语与展望

尽管在金银花中绿原酸的积累特点和生物合成途径方面的研究逐渐增多，但仍存在以下问题：（1）金银花中绿原酸的积累规律还不完全明确；（2）金银花中绿原酸生物合成途径需要进一步明确阐明，绿原酸在组织中的定位及运输仍需深入研究；（3）需要加强绿原酸生物合成途径调控研究，例如研究转录因子对该途径的调控，揭示绿原酸生物合成的调控机制有助发现高效提高绿原酸含量的方法；（4）通过组织工程的方法生产绿原酸的研究还很少，如何通过生物本身或者异源表达宿主的代谢工程来提高绿原酸产量，需要开展相关研究。