急性胰腺炎患者血浆miR-25-3p的表达水平与预后的关系

段昕妤 董红艳 吴 凯

急性胰腺炎(AP)是一种常见的消化系统疾病，其发病机制主要是胰酶异常激活诱发自身炎性反应，具有起病急、进展快、并发症多、病死率高等特点[1-3]。近年来，在中国AP的发病率呈逐年升高趋势[4]。早期对AP患者进行有效干预并评估其预后情况可提高治疗有效率，降低患者病死率。目前，临床尚缺乏准确度较高的指标用以评估AP患者的预后情况。因此，寻找有效预测AP预后的指标具有重要意义。

miRNA是一种由18～24个核苷酸构成的单链RNA，不具备编码蛋白质功能，可参与细胞的增殖、凋亡、自噬等过程[5-6]。研究报道，miR-25-3p可通过调节自噬相关基因(ATG)14-Beclin1，促进多囊肾小鼠的肾细胞增殖并抑制其自噬[7]。自噬在AP发病和进展过程中起着关键作用[8]。此外，自噬通量不足与机体炎性反应程度加重有关[9]。由此推测，miR-25-3p可通过调节自噬参与AP的发病和进展过程，检测其水平或可了解AP患者的预后情况。本文探究了AP患者血浆miR-25-3p的表达水平与预后的关系，以期为AP患者的预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年4月至2020年7月中国人民解放军总医院第八医学中心收治的325例AP患者作为研究对象。纳入标准：(1)根据《中国急性胰腺炎诊治指南(2019年，沈阳)》[4]诊断为AP；(2)年龄18～70岁；(3)发病24 h内入院；(4)签署了知情同意书。排除标准：(1)伴有感染性疾病，如病毒性肝炎等；(2)伴有恶性肿瘤；(3)伴有心脏疾病，如冠心病、扩张性心肌病等；(4)伴有自身免疫性疾病或长期服用免疫抑制剂。325例AP患者中，男性221例，女性104例，年龄25～69岁，平均年龄为(47.52±7.59)岁；其中酒精性AP有36例，胆源性AP有184例，高脂血症性AP有105例。本研究经医院医学伦理委员会批准(批件号：309202103031013)。

1.2 临床信息收集

收集入组受试者的年龄、性别、BMI、AP病因、急性生理与慢性健康评分Ⅱ(APACHE Ⅱ)、急性胰腺炎严重程度床边指数(BISAP)及入院28 d的生存情况。应用DxH 600血细胞分析仪[购自贝克曼库尔特实验系统(苏州)有限公司]检测患者入院24 h内白细胞计数(WBC)，采用免疫比浊法检测C反应蛋白(CRP)，采用速率法检测脂肪酶、淀粉酶水平，采用双抗体夹心法检测乳酸水平。

1.3 miR-25-3p水平检测

采用实时荧光定量PCR法检测血浆miR-25-3p水平[10]。抽取AP患者入院24 h内(T0期)、治疗1 d(T1期)和治疗5 d(T2期)时的肘部静脉血10 mL，离心后取上层清液，置于-80 ℃冰箱中待验。使用TRIzol试剂(购自日本TaKaRa公司)提取血浆中总RNA，使用反转录试剂盒(购自日本TaKaRa公司)将RNA反转录为cDNA，然后使用PCR仪[购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司]扩增cDNA，扩增条件为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共计35个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-25-3p的相对表达量，ΛCt=CtmiR-25-3p-CtU6。以U6作为内参，引物均由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 miR-25-3p水平的动态变化

根据AP患者入院后28 d的生存情况将其分为生存组(n=269)和死亡组(n=56)。生存组治疗前(T0期)、治疗1 d(T1期)和治疗5 d(T2期)的miR-25-3p相对表达量分别为0.37±0.05、0.45±0.10和0.72±0.13；死亡组T0期、T1期和T2期的miR-25-3p相对表达量分别为0.29±0.04、0.37±0.08和0.57±0.17。整体分析，两组T0期、T1期和T2期的miR-25-3p差异有统计学意义(F时间=12.598，F空间=13.514，F交互=12.854，P<0.05)。与死亡组比较，生存组T0期、T1期和T2期miR-25-3p的相对表达量均较高(t=10.925、5.741、6.472，P均<0.05)。组内比较，生存组不同时期miR-25-3p水平差异有统计学意义(P<0.001)，死亡组不同时期miR-25-3p水平差异亦有统计学意义(P<0.001)，两组miR-25-3p的表达水平随治疗时间延长均呈升高趋势，但两组的升高幅度不同，生存组miR-25-3p表达水平的升高幅度大于死亡组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：*P<0.05图1 生存组和死亡组miR-25-3p表达水平的动态变化图

2.2 miR-25-3p预测AP患者预后的价值

T0期miR-25-3p预测AP患者预后的ROC曲线下面积(AUC)、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.891(95%CI：0.853～0.929)、0.33、91.07%和74.72%；T1期miR-25-3p预测AP患者预后的AUC、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.757(95%CI：0.694～0.820)、0.41、76.79%和66.17%；T2期miR-25-3p预测AP患者预后的AUC、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.767(95%CI：0.690～0.844)、0.56、55.36%和90.33%。结果表明，T0期miR-25-3p预测AP患者预后的AUC分别大于T1期miR-25-3p和T2期miR-25-3p，差异均有统计学意义(Z=3.699，P<0.001；Z=2.775，P=0.006)。见图2。

图2 miR-25-3p预测AP患者预后的ROC曲线

2.3 生存组和死亡组的临床病理特征比较

生存组和死亡组在年龄、性别、BMI、病因、WBC和淀粉酶方面比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。与死亡组比较，生存组APACHEⅡ评分、BISAP评分、CRP、脂肪酶和乳酸水平均较低，两组差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 两组的临床病理特征比较

2.4 影响AP患者预后的因素

将AP患者入院28 d的生存情况作为因变量，将单因素分析结果中P<0.1的因素(包括APACHEⅡ评分、BISAP评分、CRP、脂肪酶、乳酸和T0期miR-25-3p)作为自变量纳入多因素logistic回归分析。因T0期miR-25-3p的AUC较大，预测效能较高，故仅纳入T0期miR-25-3p作为自变量。结果显示，APACHEⅡ评分、BISAP评分、CRP和乳酸是AP患者预后的独立危险因素(P<0.05)，T0期miR-25-3p是AP患者预后的独立保护因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响AP患者预后的多因素logistic回归分析

2.5 预后模型的构建及评价

采用多因素logistic回归模型分析法构建评估AP患者预后的模型A(由APACHEⅡ评分、BISAP评分、CRP和乳酸组成)和模型B(由APACHEⅡ评分、BISAP评分、CRP、乳酸和T0期miR-25-3p组成)，模型A公式：F=-18.155+0.609×APACHEⅡ评分+2.156×BISAP评分+0.107×CRP+1.225×乳酸，模型B方程F=-22.314+0.798×APACHEⅡ评分+2.842×BISAP评分+0.342×CRP+1.232×乳酸-5.115×T0期miR-25-3p。模型A评估AP患者预后的AUC、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.936(95%CI：0.907～0.964)、0.16、87.50%和84.39%；模型B评估AP患者预后的AUC、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.980(95%CI：0.963～0.998)、0.21、96.43%和95.91%。结果表明，模型B评估AP患者预后的AUC大于模型A，差异有统计学意义(Z=3.265，P=0.001)。见图3。模型A和模型B的校准曲线均接近理想曲线，见图4。当阈值概率>5%时，模型B评估AP患者预后的净收益高于模型A，见图5。

图3 模型A和模型B评估AP患者预后的ROC曲线

图4 模型A和模型B的校准曲线 A 模型A B 模型B

图5 模型A和模型B的风险效益决策曲线

3 讨论

在中国，AP患者的病死率为5%～10%[11]。若能早期评估患者的预后情况，及时给予针对性治疗，可大幅降低病死率。目前用于评估AP患者预后情况的指标包括血清前白蛋白、红细胞分布宽度、钙结合蛋白S100A12、Ranson评分、APACHEⅡ评分和SOFA评分等，上述指标均被证实与AP的预后存在一定关系，但单独用于评估AP患者的预后均存在一定不足，如敏感度较低、特异度较低等[12-14]。本文探究了AP患者血浆miR-25-3p水平与预后的关系，以期为AP的预后评估提供更多参考指标。

有研究报道，miR-25-3p参与了胃癌、心肌梗死和慢加急性肝衰竭等的发展过程[15-17]。另有研究表明，miR-25-3p对于前列腺癌、非小细胞肺癌的诊断和预后具有一定价值[18-19]。本研究观察了AP患者血浆miR-25-3p水平的动态变化，结果显示生存组和死亡组miR-25-3p水平随治疗时间延长均呈上升趋势，生存组T0期、T1期和T2期的miR-25-3p水平均高于死亡组，上述结果提示miR-25-3p与AP进展有关，其水平或可用于AP的预后评估。本研究构建了miR-25-3p评估AP预后的ROC曲线，结果显示T0期miR-25-3p评估AP患者预后的AUC和敏感度均较高，但特异度偏低，这提示T0期miR-25-3p对于AP的预后评估具有一定价值，其可辅助评估AP预后。鉴于T0期miR-25-3p单指标评估AP预后的不足，本研究进一步构建了评估AP预后的模型A和模型B，结果显示模型B的评估效能高于模型A，且模型B的校准曲线接近理想曲线，这提示模型B对于AP患者的预后评估具有较高价值。

APACHEⅡ评分和BISAP评分是评价AP严重程度和预后的重要参考指标，多用于评估重度AP患者预后[20-22]。多项研究表明，APACHEⅡ评分和BISAP评分与AP患者发生预后不良有关[23-24]。本研究结果显示，APACHEⅡ评分、BISAP评分、CRP和乳酸是AP患者预后的独立危险因素，T0期miR-25-3p是AP患者预后的独立保护因素。有研究报道，受转录因子激活蛋白-2α(AP-2α)正向调节的miR-25-3p可通过靶向Akt1基因参与代谢反应[25]；Akt抑制剂可通过抑制腺泡再生，促进腺泡至导管化生的进展，下调AP小鼠的炎性反应程度[26]。由此推测，miR-25-3p可能通过调节Akt1表达，抑制炎性反应，从而改善患者预后，但具体机制有待深入探究。

综上所述，AP患者血浆miR-25-3p的表达水平与预后关系密切，基于miR-25-3p构建的模型对于评估AP患者的预后情况具有一定价值。本研究的局限性在于样本量偏少，后续将开展大样本研究进一步分析模型B评估AP预后的价值及可行性。