过表达Prx5对四氯化碳诱导的肝纤维化模型大鼠的作用及机制研究

王 春 陈丽康 王才党

肝纤维化是由非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、慢性乙型肝炎病毒或慢性丙型肝炎病毒感染所引发的一种以肝细胞外基质过量沉积、纤维结缔组织增生为病理特征的疾病[1-3]。肝纤维化患者若不及时给予救治，随病程进展易发展为肝硬化，甚至导致肝细胞癌，严重威胁人们的生命健康[4]。探寻抑制肝纤维化进展的药物及作用靶点对其治疗方案的选择有重要意义。过氧化物酶5(Prx5)可以调控氧化应激和AMP激活的蛋白激酶途径，改善由高脂饲料饲养诱导的非酒精性脂肪性肝病[5]。近年来有研究指出，过表达Prx5可通过抑制信号转导与转录激活因子3(STAT3)的活化，改善由转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的大鼠肾纤维化[6]。目前关于Prx5对肝纤维化的作用的报道较少。本文探究了过表达Prx5对由四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型大鼠的影响和作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只SD大鼠，SPF级，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司[实验动物许可证号SCXK(京)2009-0004]，雌雄各半。所有大鼠于(23±2)℃、60%湿度的环境下适应性饲养1周，昼夜交替间隔为12 h，期间给予充足的水和普通饲料。

1.2 试剂和仪器

CCl4、4%多聚甲醛、梯度乙醇均购自武汉博士德生物工程有限公司，BCA蛋白定量测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，抗Prx5、TGF-β1及STAT3抗体均购自北京孚博生物科技有限公司，H-E染色试剂盒及Masson染色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，1658001型垂直电泳槽购自美国Bio-Rad公司，DYCP-31C型琼脂糖水平电泳仪购自北京六一生物科技有限公司，JXFSTPRP-Ⅱ-02型组织研磨机购自上海净信实业发展有限公司。引物由南京善本生物科技有限公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 肝纤维化大鼠模型的构建及分组

从40只SD大鼠中随机抽取10只作为对照组，给予腹腔注射橄榄油处理。另外30只大鼠给予腹腔注射含40% CCl4的橄榄油溶液处理，注射剂量为2 mL/kg，每周2次，持续6周[7]。采用H-E染色法判断肝纤维化大鼠模型是否造模成功。初始给药4周后，将30只大鼠随机分为模型组、空载体组和过表达Prx5组，每组10只。空载体组每周经尾静脉注射含空载质粒的慢病毒1次，过表达Prx5组每周经尾静脉注射含过表达Prx5质粒的慢病毒1次，持续2周。采用实时荧光定量PCR法检测过表达Prx5是否成功。

1.4 肝脏组织中羟脯氨酸水平检测

所有大鼠在饲养7周后，使用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后处死，取其肝脏组织。使用组织研磨机研磨肝脏组织，获取组织匀浆。采用ELISA法检测各组大鼠肝脏组织中羟脯氨酸的表达水平，试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.5 H-E染色和Masson染色

取部分肝脏组织，使用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，然后脱蜡处理，使用梯度乙醇进行水化。采用H-E染色法观察肝脏组织的病理变化，采用Masson染色法观察肝脏组织的胶原纤维沉积情况[8-9]。

1.6 Prx5 mRNA、TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA表达水平检测

采用实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝脏组织中Prx5 mRNA、TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA的表达水平[10]。取1.4步骤中的肝脏组织匀浆，室温环境下3 500 r/min离心15 min，离心半径为8 cm。取离心后上清液，滴加至总RNA提取试剂盒(购自瑞士罗氏公司)中提取总RNA，并用722型紫外分光光度计(上海光学仪器五厂有限公司)检测其纯度。取2 μg总RNA置于反转录试剂盒(购自瑞士罗氏公司)中进行反应，然后将反应产物置于PTC-200型PCR仪(购自美国Bio-Rad公司)中进行扩增，扩增条件为95 ℃预变性10 min，之后95 ℃ 30 s、55 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s，共40个循环。以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

1.7 Prx5、TGF-β1和STAT3蛋白水平检测

采用蛋白质印迹法检测Prx5、TGF-β1和STAT3的蛋白水平[11]。取部分肝脏组织，加入RIPA裂解液提取总蛋白，120 V电压下电泳100 min，200 mA电流转膜90 min，加脱脂牛奶室温封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗3次，每次10 min，加二抗室温孵育1 h，PBST洗3次，每次10 min，曝光显影，应用ImageJ软件分析光密度。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏组织羟脯氨酸水平比较

对照组、模型组、空载体组和过表达Prx5组大鼠肝脏组织中羟脯氨酸的表达水平分别为(0.26±0.05)μg/mg、(0.74±0.13)μg/mg、(0.71±0.12)μg/mg和(0.38±0.09)μg/mg。与对照组比较，模型组羟脯氨酸的表达水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组和空载体组比较，过表达Prx5组羟脯氨酸的表达水平较低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1。

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与空载体组比较，cP<0.05图1 各组大鼠肝脏组织中羟脯氨酸的表达水平比较

2.2 各组大鼠肝脏组织的病理变化

H-E染色和Masson染色的结果显示，与对照组比较，模型组大鼠肝脏组织细胞变性和坏死程度均明显加重，并伴有广泛的炎性细胞浸润和胶原纤维沉积；与模型组和空载体组比较，过表达Prx5组的细胞变性和坏死程度均明显减轻，这提示肝纤维化程度减轻。见图2、3。

图2 各组大鼠肝脏组织的病理图像 H-E染色 ×100 A 对照组 B 模型组 C 空载体组 D 过表达Prx5组

图3 各组大鼠肝脏组织的胶原纤维沉积情况 Masson染色 ×100 A 对照组 B 模型组 C 空载体组 D 过表达Prx5组

2.3 各组大鼠肝脏组织中Prx5 mRNA、TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA表达水平比较

与对照组比较，模型组大鼠肝脏组织中Prx5 mRNA的相对表达量较低，而TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA的相对表达量较高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达Prx5组大鼠肝脏组织中Prx5 mRNA的相对表达量较高，而TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA的相对表达量较低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肝脏组织中Prx5 mRNA、TGF-β1 mRNA和STAT3 mRNA表达水平比较

2.4 各组大鼠肝脏组织中Prx5、TGF-β1和STAT3蛋白水平比较

与对照组比较，模型组大鼠肝脏组织中Prx5蛋白水平较低，而TGF-β1和STAT3蛋白水平较高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与模型组和空载体组比较，过表达Prx5组大鼠肝脏组织中Prx5蛋白水平较高，TGF-β1和STAT3蛋白水平较低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图4、表3。

注：A指对照组，B指模型组，C指空载体组，D指过表达Prx5组图4 各组大鼠肝脏组织中Prx5、TGF-β1和STAT3的蛋白电泳图

表3 各组大鼠肝脏组织中Prx5、TGF-β1和STAT3蛋白水平比较

3 讨论

本研究采用腹腔注射CCl4的方法构建了肝纤维化大鼠模型，通过检测大鼠肝脏组织羟脯氨酸的表达水平，以及观察肝脏组织的病理变化，从而判断造膜是否成功。结果发现，在给予CCl4后，大鼠肝脏组织中羟脯氨酸的表达水平升高，肝细胞发生变性和坏死，有大量炎性细胞浸润，肝脏组织胶原纤维沉积严重。上述结果提示肝纤维化大鼠模型造模成功，可用于后续研究。

Prx属于过氧化物酶，具有清除哺乳动物细胞中活性氧及过氧亚硝酸盐的能力[12]。Prx5作为Prx家族中的一员，可通过催化保守的过氧化物N端半胱氨酸中的分子内二硫键及还原C端半胱氨酸的残基，降低过氧化氢、过氧亚硝酸盐及烷基氢过氧化物等的表达水平[13]。Prx5主要通过炎性反应刺激而发挥作用，有研究表明Prx5在脂多糖诱导的巨噬细胞及小胶质细胞中高表达，并发挥抗氧化作用，抑制氧化应激损伤[14-15]。目前，关于Prx5在抗氧化应激及炎性反应调节方面作用的报道逐渐增多，但关于其与肝纤维化关系的报道仍较少。羟脯氨酸是胶原纤维的重要组成成分之一，其在肝脏组织中表达水平升高提示胶原纤维增多，纤维化程度加重。本研究结果表明，过表达Prx5组大鼠肝脏组织中羟脯氨酸表达水平降低，且病理图像显示其肝细胞组织形态、炎性细胞浸润及胶原纤维沉积情况均得到有效缓解，该结果提示过表达Prx5对肝纤维化大鼠的肝脏组织具有一定的保护作用，可抑制肝纤维化进展。

研究表明，TGF-β1可通过调控细胞外基质的代谢参与多种脏器纤维化的发生及发展过程[16]。在肝纤维化中，TGF-β1可促进成纤维细胞聚集、增殖和分化，同时上调细胞外基质的表达水平，致使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，从而促进肝纤维化进展[17]。此外，STAT3的活化在TGF-β1调控细胞外基质代谢的过程中起着重要作用[18-20]。本文探究了过表达Prx5对TGF-β1/STAT3信号转导通路的影响，结果表明过表达Prx5可降低肝纤维化大鼠肝脏组织中TGF-β1和STAT3的mRNA及蛋白水平，这提示过表达Prx5可能通过调控TGF-β1/STAT3信号转导通路而发挥其抗肝纤维化作用。

综上所述，过表达Prx5对由CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠有一定的保护作用，可降低大鼠肝脏组织中羟脯氨酸的表达水平，缓解肝脏中炎性细胞浸润及胶原纤维沉积状况，其作用机制可能与调控TGF-β1/STAT3信号转导通路有关。