通过式高效净化-高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中噁唑菌酮残留

◎ 张晓莉，孙 晶，汤苗苗，师敬敬，李芳芳，辛 莹

（河南广电计量检测有限公司，河南 郑州 450001）

噁唑菌酮是一种新型高效、广谱的杀菌剂．属于线粒体呼吸抑制剂，能中止细胞的氧化磷酸化作用，从而使细胞失去能量来源而死亡[1]。噁唑菌酮在农作物种植的病虫害防治中应用广泛，同时也容易在土壤、水体、农作物中残留，造成环境污染并影响食品质量安全。残留的噁唑菌酮可通过食物链在畜禽动物组织中富集，对广大消费者的健康造成威胁[2]。我国《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）中规定，噁唑菌酮在哺乳动物肉类残留最大限量为0.5 mg·kg-1。

农药残留对人体的危害影响较大，因此要加强对食品中农药残留的检测。液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS/MS）定性准确，灵敏度高，已经被广泛应用于农药、兽药残留领域的定性、定量等确证检测工作中[3]。目前，仅噁唑菌酮在动物源性产品的检测方法中未查询到相关报道。猪肉作为一种日常消费食品，出于安全性考虑，非常有必要建立一种能应用于猪肉中检测农药残留的方法。为满足实际需要，本研究以猪肉为对象，建立一种采用通过式高效净化-高效液相色谱-串联质谱检测猪肉中噁唑菌酮的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪HPLCMS/MS（Xevo TQD，美国Waters公司）；Vortex-2涡旋混合仪（德国IKA公司）；CT14RDⅡ高速冷冻离心机（上海精科天美公司）；分析天平（德国Sartorius公司）；EFAA-DC24RT氮吹浓缩仪（上海安谱公司）；Milli-Q Advantage A10 纯水机（美国Merck Millipore公司）。

1.2 材料与试剂

乙腈、甲醇、乙酸铵（色谱纯，美国Fisher公司）；固相萃取柱Oasis® PRIME HLB（6 mL，200 mg，Waters公司）；实验用水为超纯水。噁唑菌酮标准品（100 mg·L-1，BePure公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标液配制

用移液枪准确移取1.0 mL噁唑菌酮标准品（100 mg·L-1），用乙腈定容至10 mL，配成浓度为10 mg·L-1的储备液。用空白基质溶液配制成1.0～50 μg·L-1的噁唑菌酮标准工作液，现用现配。

1.3.2 色谱条件

BEH-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流速：0.3 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；流动相A为10 mmol·L-1乙酸铵溶液（含0.1%甲酸），B为乙腈；洗脱程序：0～1 min，60%A；1～3 min，60%～5%A；3～5 min，5%A；5～5.1 min，5%～60%A；5.1～6 min，60%A。质谱条件：电喷雾负离子模式（ESI-），毛细管电压：2.6 kV；离子源温度：150 ℃；去溶剂温度：500 ℃；多反应监测模式（MRM），检测条件见表1。

表1 噁唑菌酮多重反应监测条件表

1.3.3 样品前处理

猪肉样品匀浆，称取5 g（精确至0.001 g）试样于50 mL聚乙烯离心管中，加入10 mL 1%甲酸乙腈、5 g氯化钠，涡旋振荡15 min，超声提取15 min，冷冻离心后，转移上清液，残留物用10 mL 1%甲酸乙腈重复提取。合并两次上清液，45 ℃水浴旋转浓缩至近干，加水定容至2 mL，过PRIME HLB净化柱，收集全部净化液。取1 mL净化，加水定容2 mL，过0.22 μm滤膜，供HPLC-MS/MS分析。

2 结果与分析

2.1 色谱-质谱条件优化

本研究以C18为色谱柱，比较了乙腈、甲醇为流动相，以及添加不同浓度甲酸和乙酸铵溶液对噁唑菌酮分离及响应的影响。实验表明，采用梯度洗脱，以乙腈-10 mmol·L-1乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）为流动相时，噁唑菌酮分离效果较好，灵敏度高。

质谱选用电喷雾离子源，多反应监测模式（MRM）下进行全扫描，考察了在ESI+和ESI-两种模式下噁唑菌酮各碎片离子的响应值，最终确定定性和定量离子以及相关仪器条件，见表1。

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取条件选择

乙腈极性大、穿透力强，可减少样品中脂溶性杂质的溶出，常用于农药残留的分析检测[4]。本实验比较了乙腈、1%甲酸乙腈和80%乙腈作为提取溶剂的提取效果，通过在空白猪肉样品中加入一定量的噁唑菌酮标准溶液，使加标浓度为20 μg·kg-1，比较3种不同提取剂的回收率，其提取效果见图1。其中1%甲酸乙腈回收率最高，达93.5%，因此选用1%甲酸乙腈作为前处理提取剂。

图1 3种提取溶剂测定猪肉中噁唑菌酮的回收率图

2.2.2 净化条件选择

猪肉中含有大量的脂肪和磷脂，会对目标物检测造成干扰，为降低实验成本，本实验优先选用正己烷进行除脂。样品经1%甲酸乙腈提取后，加正己烷除酯净化，实验结果发现噁唑菌酮回收率低于60%，原因是噁唑菌酮在正己烷中也可以溶解，使样品在除脂净化中损失较大，故本实验考虑其他净化手段。Oasis® PRIME HLB固相萃取小柱具有独特的亲水-疏水平衡性，其吸附剂为强亲水性聚合物，能有效去除脂肪，磷脂等干扰杂质[5]。因此本实验采用该萃取柱进行净化。由图2可以看出，经Oasis® PRIME HLB固相萃取小柱净化后，脂肪，磷脂等杂质对样品中噁唑菌酮色谱峰干扰明显下降，且色谱峰形有很大改善。

图2 噁唑菌酮经Prime萃取柱净化前后离子流色谱图对比图

2.2.3 基质效应

基质效应（Matrix Effect，ME）是指在色谱分离时，同时洗脱的物质改变了待测组分的离子化效应，而对待测组分信号造成的影响和干扰[6]。可通过基质标准曲线和溶剂标准曲线斜率的比值对目标物的基质效应进行考察。当比值ME＞1时，则为基质增强效应，比值ME＜1时，则为基质抑制效应。本实验表明，噁唑菌酮在猪肉中ME为0.856 2，即在猪肉中存在基质抑制效应，为减少该效应，提高分析结果准确性，本实验采用基质标准曲线进行定量分析。

2.2.4 方法学研究

将空白猪肉样品按1.3.3节进行前处理，添加不同浓度的噁唑菌酮标准品（1.0～50.0 μg·L-1），采用2.1方法测定，以质量浓度为横坐标，以对应峰面积为纵坐标进行线性拟合，绘制基质标准曲线。结果表明，噁唑菌酮在1.0～50 μg·L-1线性范围内，相关系数R2为0.995 0，线性关系良好。空白猪肉样品在0.01 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.05 mg·kg-13个加标浓度下，回收率在82%～89%，相对标准偏差（RSD）在0.3%～1.1%，见表2。根据仪器3倍和10倍信噪比，结合浓度外推法确定方法检出限和定量限，最终得出噁唑菌酮的检出限（LOD）为1.0 μg·kg-1，定量限（LOQ）为3.3 μg·kg-1。

表2 噁唑菌酮在猪肉中添加回收结果表

3 结论

以猪肉为研究对象，建立了噁唑菌酮的分析测定方法。样品经1%酸化乙腈提取，经旋转蒸发仪浓缩后加水混匀，经Oasis PRIME HLB柱净化，HPLCMS/MS分析。该方法前处理操作简便，灵敏度高，适用于猪肉中噁唑菌酮的检测和确证，为我国检测动物源产品中噁唑菌酮的残留量提供参考。