MANF对A2型反应性星形胶质细胞增殖、凋亡的影响

刘 锐,丁振飞,戴 策,钟 林,汪萧和,尹宗生,高维陆

星形胶质细胞在神经系统中所占的比例最大，在神经胶质细胞中分布最为广泛，也是胶质细胞中体积最大的一种。中枢神经系统中的星形胶质细胞能够对不同性质的刺激做出不同的反应，活化为具有消极作用的A1型反应性星形胶质细胞(reactive astrocytes,RAS)和有积极作用的A2型RAS。有研究表明，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)可以使星形胶质细胞向A2型RAS转化。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)是近年来新发现的一种分泌型蛋白，存在于内质网和高尔基体中。MANF能够在多种细胞中发挥生物学功能。但其在脊髓损伤中对RAS的影响却未见相关文献报道。该研究拟通过在体外进行大鼠脊髓星形胶质细胞的培养，并制备A2型RAS，采用不同浓度的MANF处理，并检测其对A2型RAS增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

胎牛血清、DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；重组MANF蛋白、小鼠抗S100A10单克隆抗体(美国R&D Systems公司)；CCK-8试剂(上海陶素生化科技有限公司)；链霉素-青霉素、EdU试剂盒、TUNEL试剂盒(上海Beyotime生物技术公司)；兔抗GFAP单克隆抗体(美国Abcam公司)。倒置荧光显微镜(德国蔡司公司)，酶标仪(美国PE公司)。

1.2 实验动物

SPF级SD大鼠50只，3～4周龄，雌雄不拘，由安徽省实验动物中心提供。

1.3 方法

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星形胶质细胞的制备 SD大鼠脱颈处死后，在无菌条件下取出脊髓组织，迅速转入含有用冰预冷的PBS液的培养皿中，用眼科剪将组织块剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，反复吹打后经200目细胞筛过滤，滤液收集于15 ml离心管中，转入离心机离心5 min，转速为800 r/min，然后弃上清液，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12星形胶质细胞培养液2 ml，之后用枪头反复吹打细胞悬液使其重悬均匀。将细胞密度调整为5×10/ml，分装接种到培养瓶，置于37 ℃、5%CO细胞培养箱内培养。培养至第14天，将细胞瓶固定于37 ℃恒温摇床，120 r/min振荡18 h。弃去培养基，以新鲜的培养基洗涤培养瓶2遍。加入胰酶，当细胞由多角形变成圆形，细胞间隙变大，胞体变亮，小心弃去胰酶。加入新鲜的培养基将细胞重悬成单细胞悬液，置于37 ℃、5%CO培养箱内继续培养。

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星形胶质细胞的鉴定 待细胞融合度达到80%左右时，经4%多聚甲醛室温固定、0.3% TritonX-100室温下通透，正常羊血清工作液室温封闭后，加入兔抗GFAP单克隆抗体，4 ℃过夜，再加入FITC标记的羊抗兔IgG，避光保存，室温孵育1 h。DAPI避光孵育染核20 min，滴加抗荧光淬灭封片甘油，封片后荧光显微镜观察。

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A2型RAS的制备及鉴定 取对数生长期的星形胶质细胞，在细胞培养基中加入终浓度为10 ng/ml的IL-1β，放入37 ℃、5%CO培养箱中继续培养。细胞培养3 d后，行免疫荧光染色，方法同上，所用一抗为兔抗GFAP单克隆抗体和小鼠抗S100A10单克隆抗体，二抗为FITC标记的羊抗兔IgG和TRITC标记的羊抗小鼠IgG。以未经IL-1β处理的星形胶质细胞为对照组。

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CCK-8实验 取生长正常的A2型RAS接种至96孔板中，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的(0、0.5、1、2 μg/ml)MANF蛋白，放入37 ℃、5%CO培养箱中培养24 h后，弃各孔培养基，向每孔加入90 μl培养基、10 μl CCK-8溶液继续培养4 h。而后再用酶标仪测定450 nm处的吸光度，该实验重复3次。采取同上的方法，加入终浓度1 μg/ml MANF蛋白，分别在12、24、36、48 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度，该实验重复3次。

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5-乙炔基-2-脱氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)掺入试验 取生长状态正常的A2型RAS接种至24孔板中，细胞贴壁后分3组进行试验，空白组只加细胞，Control组加入2×的EdU，MANF组加入2×的EdU和终浓度1 μg/ml的MANF蛋白，继续培养24 h后进行荧光检测。该实验重复3次。

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TUNEL实验 取生长状态正常的A2型RAS接种至24孔板中，细胞贴壁后分为2组，空白对照组不做任何处理，MANF组加入终浓度1 μg/ml的MANF蛋白，继续培养24 h后，加入TUNEL检测液孵育60 min后进行荧光检测。该实验重复3次。

2 结果

2.1 大鼠脊髓星形胶质细胞的培养与鉴定

大鼠脊髓星形胶质细胞分离培养14 d后用倒置显微镜观察细胞基本铺满培养皿底(图1A)，将细胞瓶固定于37 ℃恒温摇床，120 r/min振荡18 h后传代，第2天可见纯化的星形胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长而分支的突起(图1B)。免疫荧光结果显示绝大多数细胞呈GFAP阳性，显绿色荧光(图2)即为星形胶质细胞。DAPI染核，胞核呈蓝色，为总细胞数，可见星形胶质细胞纯度较高。

图1 大鼠脊髓星形胶质细胞 ×40A:星形胶质细胞原代14 d；B：纯化后传代2d的星形胶质细胞

图2 星形胶质细胞的鉴定 ×100

2.2 A2型RAS的鉴定

根据A2型RAS特定表达S100A10的特性，应用细胞免疫荧光方法染色结果显示IL-1β处理的实验组可见A2型RAS特异性蛋白S100A10被染成红色，未处理空白对照组仅有少量红色，DAPI复染后细胞核呈蓝色，提示绝大多数细胞为A2型RAS。见图3。

图3 A2型RAS细胞的鉴定 ×100

2.3 MANF蛋白对A2型RAS增殖具有时间和浓度依赖性

CCK-8结果显示，不同浓度的MANF蛋白(0.5、1、2 μg/ml)对A2型RAS具有促进增殖的作用(图4A)，而且不同作用时间(12、24、36、48 h)促进增殖的能力不同(图4B)，呈时间和浓度依赖性(

P

<0.05)；当浓度达到2 μg/ml时促增殖的效果最好，与对照组比较差异有统计学意义(

t

=9.951，

P

<0.05)，在12 h的细胞增殖活力与对照组相比，差异无统计学意义。

图4 MANF蛋白对A2型RAS增殖的影响A：不同浓度MANF对A2型RAS的影响 ；B：不同作用时间对A2型RAS的影响 ；与Control组比较：*P<0.05

2.4 MANF蛋白对A2型RAS增殖有促进作用

为了研究MANF对A2型RAS增殖的影响，进行了EdU掺入试验，分析细胞增殖情况。结果显示与对照组(25.5%)相比，MANF组(44.5%)的EdU阳性细胞数量增加了(图5、6)，这些数据表明MANF对A2型RAS增殖具有促进作用。

图5 EdU检测细胞增殖的效果图 ×100

图6 EdU阳性细胞所占的比例与Control组比较： **P<0.01

2.5 MANF蛋白对A2型RAS凋亡具有抑制作用

为了研究MANF对A2型RAS的凋亡的影响，因此，进行TUNEL分析细胞凋亡的情况。图7为倒置显微镜下明场拍摄的A2型RAS，图8为TUNEL染色阳性细胞，与Control组(凋亡的阳性对照)细胞相比，MANF组的细胞中仅观察到少量TUNEL阳性染色，这表明MANF可以抑制细胞凋亡。

图7 TUNEL检测细胞凋亡的效果图 ×200

图8 凋亡细胞所占比例与Control组比较：*P<0.05

3 讨论

星形胶质细胞在中枢神经系统中所占的比例最大，是维持中枢神经系统结构和生理功能的基础。星形胶质细胞对缺血、感染、创伤及退行性改变等各种形式的中枢神经系统损害都能迅速做出反应，在形态和功能上发生剧烈的变化，形成RAS。最近，有研究者在制备了炎性和缺血性病变两种不同性质的中枢神经系统损伤小鼠模型后，分离培养两种损伤模型小鼠的RAS，研究者将炎性病变诱导产生的RAS命名为A1型RAS，缺血性病变诱导产生的RAS命名为A2型RAS。其中A1型RAS上调许多经典的补体级联基因，这些基因对突触具有破坏性，因此推测A1型RAS可能发挥消极的作用。而A2型RAS能够分泌多种神经营养因子，因此推测A2型RAS可能发挥积极的作用。有研究表明，A2型RAS能够促进抗炎细胞因子转化生长因子β的表达。该因子有助于轴突形成和神经保护的作用。

大量的证据表明MANF在多种疾病中均具有保护作用，包括脑缺血、心肌梗塞、视网膜变性。最近有研究证明其可通过抑制眼部组织炎性细胞因子的表达，从而抑制自身免疫性葡萄膜炎。体外细胞培养实验同样证明MANF蛋白能够激活促存活信号通路。本研究以大鼠脊髓星形胶质细胞为研究对象，通过对A2型RAS的制备，观察不同浓度MANF对A2型RAS增殖活力的影响，结果显示，MANF可促进脊髓A2型RAS增殖并抑制其凋亡，从而发挥神经修复作用。本研究可能为脊髓损伤的治疗提供一个新的思路，但本研究也存在着一定的不足，MANF对促进A2型RAS增殖并抑制其凋亡具体分子机制尚未明确，后续还需进行更深入的研究。