产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖的提取和抗血流感染作用的研究

章 杨，周 强，陈礼文，刘 周,韩清珍，史进方

产丙酮酸棒状杆菌(

Corynebacterium

pyruviciproducens

，CP)由Tong et al在1例腹股沟脓肿中发现的一种革兰阳性棒状杆菌。另有研究表明CP与传统的免疫佐剂痤疮丙酸杆菌(

Propionibacterium

acnes

)相比，CP的免疫调节能力更强。肽聚糖(peptidoglycan，PGN)是细菌细胞壁的特有组成成分，可以刺激免疫细胞，发挥各种免疫调节作用，发挥该作用的机制与途径取决于细胞壁中PGN的含量与结构。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant

Staphylococcus

aureus

，MRSA)是医院血流感染的主要致病菌。通过前期实验证实，产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖(CP-PGN)对MRSA血流感染具有明显的防治效果。为研究CP-PGN对革兰阴性菌及真菌是否有同样的抗血流感染作用，该研究选取了医院感染中具有代表性的革兰阴性杆菌-多重耐药的肺炎克雷伯菌(

Klebsiella

pneumoniae

，KPN)及真菌-白色念珠菌(

Candida

albicans

，CAL)，建立小鼠血流感染模型，探讨CP-PGN对不同病原菌的抗血流感染能力，为将细菌性免疫调节剂作为临床血流感染的一种辅助治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌及实验动物

产丙酮酸棒状杆菌由美国加州大学洛杉矶分校 Olive View 医学中心提供；产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖由苏州大学附属第一医院中心实验室提取并保存；多重耐药的KPN、CAL均为苏州大学附属第一医院临床分离株；BABL/c 小鼠6～8周龄，体质量(25±2)g，雌性，15～18只，购自扬州大学实验中心，按照动物房的标准条件进行饲养。

1.2 主要试剂与仪器

溶菌酶购自美国Amresco公司。酶标仪购自美国BioTek公司；超声破碎仪购自美国SONICS公司；S433D型氨基酸分析仪购自德国SYKAM公司。

1.3 方法

1

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3

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1

CP菌体的制备 将冻存的CP菌株进行活化培养，无菌挑取一定量的菌落接种于含5%植物油的LB培养基中，37 ℃恒温振荡箱中振荡培养48 h后将培养液离心，收集菌体，最后用无菌生理盐水多次洗涤离心直至菌体沉淀为乳白色，静置，待水分自然蒸发后对其称重。

1

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3

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2

CP

-

PGN的提取 采用三氯乙酸法(TCA法)提取PGN。取洗涤离心得到的80 g CP菌体，提取步骤主要包括磷壁酸的去除、蛋白的去除、脂类物质的去除，再用无水乙醇脱水并称重(干燥前)，置于70 ℃恒温烘箱中彻底烘干，最终得到褐色胶状物(干燥后)。根据下列公式计算肽聚糖提取率：

肽聚糖提取率(%)=干燥前肽聚糖重量/收集的菌体重量×100%

1

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3

.

3

CP

-

PGN的纯度验证 采用溶菌酶溶解试验，用0.1 mol/L pH6.2的PBS将溶菌酶配成200 μg/ml的溶液。将一定量的CP-PGN加入该溶液中配制成5 mg/ml 的终溶液，立即用BioTek酶标仪在450 nm处读取第1个吸光度值，然后于37 ℃恒温摇床中140 r/min振荡反应，每小时读取1个吸光度值并记录。

1

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3

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4

CP

-

PGN的结构分析 将提取的CP-PGN送至科谱研发技术中心(青岛)有限公司，对其分子量、结构(傅里叶红外光谱分析)进行分析。

1

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3

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5

CP

-

PGN的氨基酸组成 将一定量的提取物与6 mol/L的盐酸溶液在110 ℃的真空条件下作用20 h，经氨基酸分析仪检测该肽聚糖的氨基酸组成。

1

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3

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6

CP和CP

-

PGN的抗感染动物模型构建

1

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3

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6

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1

热灭活的CP及CP-PGN溶液的制备 收集培养48 h后的CP菌液，离心去上清液。再用灭菌PBS离心洗涤沉淀2遍，去上清液。将该沉淀加入灭菌PBS充分混匀，置于62 ℃水浴灭活3 h后，通过将溶液接种于血琼脂平板培养检测是否完全灭活。剩余的CP菌液分装保存备用。将一定量的固体状CP-PGN溶解于灭菌PBS中，通过超声破碎仪进行破碎溶解，配制成相应浓度的溶液供后续实验使用。

1

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3

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6

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2

感染病原菌的制备 将临床分离的KPN和CAL接种于LB培养液中，培养24 h后的细菌培养液用灭菌PBS进行10、10、10一系列倍数稀释，具体操作方法为：分别吸取1 μl KPN/CAL培养液加入到含有999 μl灭菌PBS的灭菌EP管中进行10稀释；将该稀释液按照同样的方法再次进行10稀释，配制成稀释10的稀释菌液；最后将稀释10的稀释菌液分别进行10、100、1 000倍稀释后，将100 μl的该稀释菌液置于血平板中，用一次性L型无菌涂布棒采用平板涂布法使其均匀分布整个血平板，于37 ℃培养箱中培养24 h后计数平板中的菌落数，根据稀释倍数将菌液稀释成最终注射浓度。

1

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3

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6

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3

动物感染模型的构建 构建KPN/CAL血流感染的动物模型。6～8周的BALB/c小鼠随机分成对照组(Control组)、产丙酮酸棒状杆菌组(CP组)和产丙酮酸棒状杆菌肽聚糖组(CP-PGN组)，每组5～6只。参考相关文献对小鼠CP/CP-PGN的最佳注射浓度进行多次摸索，注射一定浓度的CP/CP-PGN后，主要根据小鼠的精神状态、活跃程度、呼吸频率等指标确定最佳注射剂量。经小鼠尾静脉分别注射灭菌PBS、CP(500 μg/只)、CP-PGN(100 μg/只)。24 h后3组小鼠同时尾静脉注射KPN(10×10/只)/CAL(1×10/只)菌液。观察小鼠的精神状态、活动情况，记录小鼠的生存时间。获取3组小鼠的脾脏组织，对其重量和体积(长×宽×高)进行测量和分析。

2 结果

2.1 CP-PGN提取率的计算

本次实验共收集了80 g CP菌体，最终提取的肽聚糖量为0.241 4 g，则该肽聚糖提取率为0.3%。

2.2 溶菌酶溶解实验

CP-PGN与溶菌酶溶液作用后的吸光度值变化如图1所示，在最开始的2 h内吸光度值大幅度的降低，2 h之后吸光度值趋于稳定。表明提取物可以被溶菌酶降解，证实为肽聚糖。

图1 肽聚糖的溶菌酶溶解实验

2.3 CP-PGN的结构分析

图2显示CP-PGN的分子量为18 774 u。图3的傅里叶红外光谱分析显示，提取的CP-PGN在3 500～3 200 cm、3 000～2 800 cm、1 400～1 200 cm处存在多糖类物质的特征吸收峰；1 650 cm处是酰胺特征吸收峰；862 cm处是β-吡喃糖苷件吸收峰；1 560～1 540 cm处为N-H变角振动峰；1 055 cm处有C-O振动吸收峰和O-H变角振动峰2个峰。

图2 肽聚糖分子量分析结果

图3 肽聚糖傅里叶红外光谱分析

2.4 CP-PGN的氨基酸组成及含量

CP-PGN的氨基酸组成及其含量见表1所示，结果表明CP-PGN的氨基酸组成中，含量较多的依次为谷氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸。

表1 肽聚糖的氨基酸组成及其含量[n(%)]

2.5 CP-PGN能增强小鼠抗KPN/CAL引起的血

流感染的能力

在小鼠感染KPN/CAL之前，提前注射CP/CP-PGN，可显著增强小鼠的抵抗力。CP和CP-PGN两组的小鼠精神状态、活动度等均高于Control组小鼠，CP-PGN组作用更明显。绘制的生存曲线显示， CP-PGN能有效延长KPN/CAL感染组小鼠的生存时间，提高存活率，差异有统计学意义(

P

<0.05)，如图4所示。脾脏是机体的一种重要免疫器官，它的重量和大小能够间接反映机体的免疫功能。感染KPN后，CP组小鼠的脾脏体积和重量明显大于Control组(

t

=4.824，

P

=0.008；

t

=5.266，

P

=0.004)；而在CAL感染后，CP-PGN组小鼠的脾脏体积和重量明显大于Control组，差异有统计学意义(

t

=5.639，

P

=0.008；

t

=3.560，

P

=0.02)，说明在感染KPN/CAL之前注射CP或CP-PGN，对小鼠的免疫能力产生不同程度的影响，如图5、6所示。

图4 KPN/CAL血流感染模型的小鼠生存曲线与Control组比较：*P<0.05；CP：C. pyruviciproducens；CP-PGN：PGN of C. pyruviciproducens

图5 KPN血流感染模型小鼠的脾脏指标与Control组比较：**P<0.01；CP：C. pyruviciproducens；CP-PGN：PGN of C. pyruviciproducens

图6 CAL血流感染模型小鼠的脾脏指标(体积与重量)与Control组比较：*P<0.05，**P<0.01；CP：C. pyruviciproducens；CP-PGN：PGN of C. pyruviciproducens

3 讨论

肽聚糖作为细菌细胞壁的主要成分，提取方法多样。本研究选用了用时短、操作简便的三氯乙酸法进行CP-PGN的提取。本次研究中CP-PGN的提取率为0.3%。提取后的终产物经过相关验证、分析与检测，表明提取的褐色胶状物主要成分即为肽聚糖。不同种类的细菌，其细胞壁的厚度及肽聚糖的含量也存在差别，因此用同种方法进行肽聚糖的提取也会造成提取率的不同，这也是本研究中CP-PGN提取率稍低的一个重要原因。为了提高提取效率，更好地保持其结构的完整性，CP-PGN的提取方法还有待进一步的摸索与优化。此外，不同种类的细菌肽聚糖，发挥的免疫调节作用因肽聚糖的结构与含量不同而存在差异。因此本研究有关CP-PGN的分子量、结构、氨基酸等方面的分析，为后续的抗血流感染作用的研究提供理论支持。

血流感染是一种严重的全身性感染疾病，是病原菌在血液循环中短暂或者持续性的存在，能够引起患者多器官衰竭，甚至死亡，对患者的生命健康造成威胁。引起医院血流感染的病原菌可分为革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌三大类。肺炎克雷伯菌是重要的肠杆菌科细菌，引起的医院内感染越来越广泛，发生率仅次于凝固酶阴性葡萄球菌，位居医院血流感染的革兰阴性菌第二位。由于广谱抗生素的过度使用及更新换代，肺炎克雷伯菌的耐药性问题也越来越严重，从而加大了临床的治疗难度。念珠菌是院内血流感染位居第四的病原菌，其发病率和致死率不断升高。引起念珠菌血流感染的念珠菌种类多，最常见的念珠菌为白色念珠菌。近年来，真菌的耐药性也在逐渐的加重，从而导致该菌血流感染发病率的增加。在全球抗生素危机情况下，需要寻找新的预防感染及治疗方法来应对挑战，而免疫调节剂可以调动机体的免疫系统，增强免疫力，因此联合或者代替抗生素应用，为血流感染的预防与治疗提供一种新型的治疗方案，从而减轻抗生素的使用量。

本研究显示，在感染KPN/CAL之前，预先注射CP-PGN，与未注射CP/CP-PGN的对照组相比，小鼠的精神及活动状态均有所改善，明显延长了小鼠的生存时间，提高了生存率，免疫器官-脾脏在体积和重量上都有不同程度的增加，免疫能力有所增强，表明CP-PGN对KPN和CAL引起的血流感染具有一定的预防作用，可作为一种有潜力的新的免疫调节剂，为预防和治疗血流感染提供辅助治疗。在面临抗生素危机的情况下，将抗生素和合适的免疫调节剂组合治疗也是一种新的治疗方法，从而减少对抗生素的过度依赖，一定程度上缓解全球抗生素危机。以上有关CP-PGN抗KPN/CAL血流感染的相关研究数据，联合前期抗MRSA感染作用的数据证实，CP-PGN在血流感染的防治上发挥着重要作用，而CP-PGN在对抗MRSA/KPN/CAL三种病原菌的感染中发挥着不同程度的防治效果，造成效果差异的具体机制还有待后续进一步研究，为CP-PGN作为免疫增强剂在临床上的应用提供基础理论支持。