四川盆地油用牡丹种子品质地区差异及其与生态因子的关系

孙志鹏，武华卫，方 颖，赖世会，罗建勋

(四川省林业科学研究院，成都 610081)

油用牡丹(PaeoniasufruticosaAndr．)是中国独有的原生多年生小灌木，是芍药科(Paeoniaceae)芍药属(PaeoniaL.)牡丹组中结实能力强并能用来生产种籽、加工食用牡丹籽油的牡丹类型[1-3]。作为中国新兴的油料作物，油用牡丹籽含油率在20%以上，不饱和脂肪酸含量高达92%以上(其中α-亚麻酸占42%)，多项指标超过被称为“液体黄金”的橄榄油，经济价值极高[4-5]。目前，油用牡丹主要以‘凤丹’(Paeoniaostii)和‘紫斑牡丹’(P．rockii)两大品种群为栽培材料[6]，其中‘凤丹’是由杨山牡丹(PaeoniaostiaT. Hong et J. X. Zhang)经栽培演化形成的品种亚群，具耐湿热、适生性强和结实率高等特点，兼具观赏、药用和油用价值[7-8]。近年来，因其含油量高、油质好等特点，全国范围内‘凤丹’被越来越多省份引种栽植。四川省自2011年开始引种，现主要分布于成都、绵阳、乐山、巴中、达州、遂宁、南充、巴中、凉山州布拖、盐源以及阿坝州金川县等地。

目前，四川‘凤丹’产业发展还处于起步阶段，理论及实践经验不足，尚未形成适宜四川地区气候条件的系统栽培繁育技术体系；同时，受各种植区气候和土壤环境等自然因素影响，‘凤丹’种子营养成分含量差异较大。已有研究表明，环境生态因子对种子中营养成分的累积具有重要影响，适宜的生态环境条件有利于种子优良品质的形成[9-11]。目前，对于油用牡丹的研究多集中于育种栽培[12-13]、牡丹籽油的成分分析[14-15]及牡丹籽油的提取方法[16-17]等方面，关于不同生态环境下‘凤丹’种子营养成分含量差异及其与生态因子的耦合关系尚缺乏深入系统探讨。因此，研究‘凤丹’种子中营养成分的累积与生态因子的关系对生产实践具有重要指导意义。本研究以四川盆地引种的‘凤丹’种子为试验材料，进行表型性状和营养成分对比分析，并基于气象、土壤养分和海拔等生态因子，探讨各营养成分与生态因子的相关性，揭示影响种子主要营养成分的关键因子，以期为四川‘凤丹’科学栽培、高效生产和产业健康发展提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 采样地概况

本次试验种子采集于四川盆地内的12个‘凤丹’种植基地，包括巴中地区(南江县和恩阳区)、绵阳地区(梓潼县和游仙区)、成都地区(大邑县和崇州市)、乐山地区(峨边县和沐川县)、达州地区(达川区和宣汉县)以及遂宁地区(蓬溪县)。用手持GPS测定样地的经纬度和海拔，登录中国气象科学数据共享服务网查询系统(http://data.cma.cn)，获取平均降水量、日照时数、年均温、1月均温、7月均温和年均相对湿度。各采样地环境生态因子见表1。

1.2 试验材料

2020年8月，分别在12个‘凤丹’种植基地采集样品。每个采样地选择生长良好、果实发育正常的植株，采用对角线法选取20株进行球果采集，球果取回后，在实验室自然晾干，剥取种子，备用。采集‘凤丹’球果的同时采集土壤样品，在每个采样地的东、西、南、北4个方位分别采集0～20 cm土层的土壤，用四分法缩分，去除杂质后，装于自封袋中，带回实验室自然风干，备用。

表1 采样地的立地气候和土壤条件

1.3 观测指标及方法

1.3.1 种子表型性状千粒重采用四分法，随机选取100粒种子，用测量精度为0.01 g的电子天平称量；种子横径为与种柄延伸方向垂直的最大测量值，种子纵径为与种柄延伸方向一致的种子大小测量值，用测量精度均为0.01 mm的游标卡尺测定，并据此计算种形指数(种形指数=种子纵径/种子横径)。

1.3.2 种子营养成分①采用索氏抽提法测定种仁中的含油量，按照GB/T 14488.1-2008[18]进行测定。

②采用半微量凯氏定氮法测定种仁中的蛋白质含量，按照GB/T 5009.5-2010进行测定[19]。

③采用GC-MS测定牡丹籽油中5种主要的脂肪酸(亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸)[20]相对含量，按照GB/T 17376-2008[21]和GB/T 17377-2008[22]测定。

1.3.3 土壤养分含量土壤pH用酸度计直接测定；土壤有机质含量采用重铬酸钾法-外加热法测定；土壤碱解氮含量用碱解扩散法测定；土壤有效磷含量用碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法测定；土壤速效钾含量用中性乙酸铵浸提—原子吸收分光光度法测定[23-26]。

1.4 数据分析

采用SPSS19.0和Excel 2013软件对数据进行统计分析，用单因素方差分析法检测不同性状在各引种地间的差异显著性，采用Canoco5.0软件中的冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)方法分析‘凤丹’种子营养成分含量与生态因子之间的相互关系。

2 结果与分析

2.1 各样地‘凤丹’种子表型性状分析

表型性状是评价种子的重要组成部分，对衡量种子品质的优劣具有重要指导意义[27]。表2显示，4个‘凤丹’种子表型性状横径、纵径、种形指数和千粒重在12个采样地间差异均达到极显著水平(P<0.01)。其中，12个‘凤丹’采样地种子平均横径为9.05 mm，变幅为7.98～10.63 mm，其中乐山市峨边县、绵阳市游仙区、成都市崇州市均大于10 mm，绵阳市梓潼县、达州市达川区均小于8.0 mm；各采样地种子平均纵径为9.32 mm，变幅为7.75～10.86 mm，巴中市南江县、达州市宣汉县及南充市西充县均大于10 mm，仅成都市大邑县小于8 mm；各采样地种子平均种形指数为1.06，变幅为0.80～1.32，南充市西充县、达州市宣汉县、巴中市恩阳区和达州市达川区均大于1.20，绵阳市游仙区、成都市大邑县、成都市崇州市和乐山市峨边县均小于0.90；各采样地种子平均千粒重为348.85 g，变幅为311.23～393.15 g，其中巴中市南江县、成都市崇州市、乐山市峨边县及绵阳市游仙区均超过370 g，分别是最小的巴中市恩阳区的1.26、1.19、1.23和1.23倍。另外，多重比较结果显示：4个种子表型性状均在3个或3个以上的引种地存在显著差异和极显著差异，说明这些性状在不同采样地间的多样性较高；不同采样地的种子横径、纵径大小变化没有明显的规律性，但种形指数却表现出明显的随着经度的增加呈逐步增大的趋势。通过对‘凤丹’各表型性状的变异系数分析可知(表2)，在‘凤丹’4个表型性状中，平均变异系数最大的为种形指数(17.50%)，其次为横径(11.39%)和纵径(9.06%)，变异系数最小的为千粒重(8.08%)，表明千粒重的变异程度最小，而种形指数的变异程度最大。

2.2 各样地‘凤丹’种子营养成分分析

2.2.1 含油率和蛋白质含量由图1可以看出，各采样地‘凤丹’种子含油率的平均值为24.07%，变化幅度为20.5%～26.9%，超过平均值的采样地有巴中、达州和南充地区以及乐山市沐川县，并以乐山市沐川县、达州市宣汉县和巴中市南江县的含油率最高，处于26.0%～26.9%之间，而遂宁市蓬溪县的含油率最低，仅为20.5%。各采样地‘凤丹’种子蛋白质含量的平均值为17.1%，变化幅度为15.6%～19.6%，其中绵阳市游仙区、巴中市南江县和巴中市恩阳区的最高且均超过18%，分别为19.6%、18.3%和18.1%，而成都市大邑县和遂宁市蓬溪县的蛋白质含量最低，均小于16%；巴中、南充地区‘凤丹’种子的蛋白质含量高低与其含油率表现相似，也均超过平均值，而成都地区种子蛋白质含量高低同其含油率具有相同的规律，也均低于平均值。

2.2.2 脂肪酸含量图2显示，‘凤丹’种子中5种主要脂肪酸(α-亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸)含量以α-亚麻酸较高，远高于其他成分，也远高于在橄榄油中含量，因此，α-亚麻酸含量在一定程度上也决定了‘凤丹’籽油的品质[28]。其中，不同采样地‘凤丹’籽油中α-亚麻酸含量存在显著差异(P<0.05)，含量处于42.8%～47.1%之间，并以巴中市南江县、绵阳市游仙区‘凤丹’α-亚麻酸含量较高(>46%)，而以南充市西充县、达州市达川区较低(<43%)；不同采样地‘凤丹’籽油中亚油酸含量也存在显著差异(P<0.05)，含量处于15.7%～19.6%之间；不同采样地‘凤丹’籽油中棕榈酸、硬脂酸、油酸含量差异均不显著(P>0.05)，3种脂肪酸含量依次为5.23%～5.76%，1.66%～2.03%，19.8%～21.6%，均以绵阳市游仙区较高，分别达到5.76%、2.03%和21.3%。

表2 12个‘凤丹’采样地种子表型性状

不同小写字母表示样地间在0.05水平存在显著性差异 (P<0.05)图1 12个引种地‘凤丹’种子含油率和蛋白质含量The different normal letters indicate the significant difference among sampling sites at 0.05 level (P<0.05)Fig.1 Oil content and protein content of seeds from 12 ‘Fengdan’ sampling sites

图2 不同采样地‘凤丹’种子中主要脂肪酸成分含量Fig.2 Main fatty acid contents of ‘Fengdan’ seeds from different sampling sites

2.3 ‘凤丹’种子各性状相关性分析

‘凤丹’种子性状间的相关性分析结果(图3)表明：千粒重与α-亚麻酸、亚油酸含量均具有极显著相关关系，其中与α-亚麻酸呈极显著正相关(0.760)，与亚油酸呈极显著负相关(-0.701)；蛋白质与亚油酸、油酸含量具有极显著相关关系，其中与亚油酸呈极显著负相关(-0.686)，与油酸呈极显著正相关(0.665)；α-亚麻酸与亚油酸含量呈极显著负相关(-0.904)；棕榈酸与硬脂酸含量呈极显著负相关(-0.792)。

进一步对呈显著相关的因子进行线性回归分析，得到‘凤丹’种子中α-亚麻酸含量与千粒重，亚油酸含量与千粒重、蛋白质含量和α-亚麻酸含量，油酸含量与蛋白质含量，以及硬脂酸含量与棕榈酸含量的回归方程(图 4)。这为通过千粒重直接估算α-亚麻酸和亚油酸的质量分数以及各脂肪酸间的质量分数估算提供便利。

2.4 不同引种地‘凤丹’种子品质与生态因子的关系

由表3可知，前两个排序轴的累计解释量达80.61%，说明排序结果可信，能较好地解释2组变量的关系。由图5可知，立地气候对‘凤丹’种子表型性状和营养性状具有重要影响，其中立地条件对其影响最大，贡献率大小为速效钾>有机质>海拔>碱解氮>有效磷>pH；气候条件对其的贡献率大小为全年日照>1月均温>7月均温>年降雨量>年均温。速效钾对种形指数和油酸的影响较大，有机质和碱解氮对蛋白质和含油率的影响较大，海拔对种子表型性状的影响较大；同时海拔、速效钾、有效磷、碱解氮和温度等立地气候因子与种子表型性状、蛋白质、含油率、棕榈酸和α-亚麻酸正相关程度大，与硬脂酸和亚油酸呈负相关。

*、**分别表示差异显著水平为0.05和0.01。GW. 千粒重;P.含油率; pro. 蛋白质; C18∶3n3. α-亚麻酸; C18∶2n6c. 亚油酸; C16∶0.棕榈酸; C18∶0. 硬脂酸; C18∶1n9c. 油酸图3 ‘凤丹’种子各性状间相关性分析* and ** mean significant correlation between variables at 0.05 and 0.01 level. GW.1 000-grain weight; P. Oil content; pro. Protein content; C18∶3n3.α-Linolenic acid; C18∶2n6c. Linoleic acid; C16∶0. Palmitic acid; C18∶0. Stearic acid; C18∶1n9c. Oleic acidFig.3 Correlation coefficients among indexes of ‘Fengdan’ seeds

表3 种子性状与地理气候因子的RDA分析

图4 ‘凤丹’种子中显著相关性状间的回归分析Fig.4 Regression analysis of significant correlation factors of ‘Fengdan’ seeds

Alt.海拔；MAT.年均温；AT January.1月均温；AT July.7月均温；AAR.年降雨量；ASD.全年日照时数；PH.pH值；OM.有机质；K.速效钾；P.有效磷； N.碱解氮；HD.横径；VD.纵径；SSI.种形指数；TKW.千粒重；OR.含油率；Pr.蛋白质；ALA.α-亚麻酸；CLA.亚油酸；PA.棕榈酸；SA.硬脂酸；OA.油酸图5 ‘凤丹’种子性状与其立地地理气候因子的典型相关性Alt. altitude; MAT. Annual average temperature; AT January.Average temperature of January; AT July. Average temperature of July; AAR. Annual precipitation; ASD. Annual sunshine duration; pH. pH; OM. Organic matter; K. Available K; P. Available phosphorous; N. Alkali-hydrolyzable nitrogen; HD. Iransverse diameter; VD. Longitudinal diameter; SSI. Seed shape index; TKW. Thousand-grain weight; OR, Oil content; Pr. Protein; ALA. α-Linolenic acid; CLA. Linoleic acid; PA. Palmitic acid; SA. Stearic acid; OA. Oleic acidFig.5 Canonical correlation analysis between ‘Fengdan’ seed traits and geo-meteorological factors

3 讨 论

表型多样性是遗传多样性和环境多样性的综合表现，对种子性状进行差异比较和多样性研究，可一定程度上反映该物种的遗传变异大小，同时还能反映出形态变异对环境的适应关系[29-30]。本研究发现，不同采样地‘凤丹’种子各表型性状均存在极显著差异(P<0.01)，表明引种到四川盆地的‘凤丹’会对不同生境做出差异响应，表型性状变化就是其形式之一[31-32]。变异系数的差异反映了不同表型性状对环境的不同适应能力[33]，变异系数越大，表型性状差异越明显，遗传变异可能性越大。本研究中测定的表型性状变异系数为8.08%～17.50%，说明这12个采样地‘凤丹’种子表现出较为丰富的遗传多样性，这与孙佳婷等[34]在台湾栾树(Koelreuteriaeleganssubsp.formosana)的表型遗传多样性评价的研究结果一致。可见，这些性状在后期对育种材料进行选择时具有较高参考价值，可作为目标评价体系中的重要指标进行观测。其中，种形指数变异系数最大达到17.5%，而千粒重变异系数最小仅为8.08%，表明种形指数的变异水平高于千粒重性状，千粒重受到环境的影响相对较小，更趋于稳定。此外，本研究测定的籽油中α-亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸含量变异幅度均较小(2.57%～6.07%)，远低于表型性状变异系数(8.08%～17.50%)，表明表型变异强度变异明显高于营养性状变异。‘凤丹’自四川引种以来，长期适应不同的环境，可能导致相同的功能性状在不同引种地间存在显著差异。在不同的环境中，‘凤丹’通过形态变化和表型性状分化调整自身的生长发育及其与环境之间的关系，从而适应环境的变化，不同采样地种子横径、纵径大小没有明显的规律性，说明种子大小受地理因素的影响较小；种形指数表现出明显的随经度的增加逐步增大的规律。说明高经度地区‘凤丹’种子则较窄长，而低经度地区的‘凤丹’种子形态较宽短，可能与采样地的经度跨度大且涉及的种子表型性状数量多有关。

在选择相关性极强的性状组时，其中一个性状改良可同时影响其他性状改变，可在性状选择上提供不同的改良方向和选择标准[35-36]。本研究通过比较‘凤丹’种子各性状间的相关性，发现‘凤丹’种子含油率和蛋白质含量与表型性状间无显著相关关系，证明在所选表型性状中不能对油用优良单株进行间接选择；同时，本研究发现‘凤丹’种子含油率和脂肪酸组分间也无显著相关关系，而脂肪酸组分间具有不同的相关性，α-亚麻酸含量与亚油酸含量呈极显著负相关，硬脂酸含量与棕榈酸含量呈极显著正相关，该结果与向婷婷等对野生油茶种子中含油率和脂肪酸组分正相关的研究结果不一致[37]，可能是由于研究区域范围和树种差异造成的，但要提高‘凤丹’籽油的综合食用价值，不能仅将含油率作为唯一参照，还要兼顾其脂肪酸组分，特别是α-亚麻酸含量等。另外，本研究中千粒重与α-亚麻酸极显著正相关，与亚油酸呈极显著负相关，千粒重是油用牡丹产量性状和品质指标的主要构成因素[38]，通过线性回归分析以及建立回归方程，可以为通过千粒重直接估算α-亚麻酸和亚油酸的质量分数以及各脂肪酸间的质量分数估算提供便利。

种子表型性状受外界多种因子的影响，如海拔、年平均气温和经纬度等[39-40]。本研究发现土壤速效钾、有机质含量和海拔等立地条件因子，以及全年日照、1月均温和7月均温等气候条件因子对‘凤丹’种子表型的贡献率较大，这是因为土壤中速效钾和有机质含量会影响植物种子中营养化学成分的积累[39]，海拔会影响不同采样地的热、水和土等条件的空间差异，形成复杂的生境，在经过长期的地理隔离和自然选择间接影响种实的表型变异幅度[41]。同时，本研究还发现速效钾对种形指数和油酸的影响较大，有机质对蛋白质和含油率的影响较大，该结果与潘苗等[42]和罗芊芊等[43]对南方红豆杉的研究结果相近，这是因为钾元素参与植物体内的某些代谢反应，具有提高含油量的作用，有机质含量对种子中营养化学成分影响显著，从而促进植物体内有机物质合成和积累。另外，‘凤丹’种子绝大部分性状与地理气象因子的相关性表现出一致的趋势，主要表现为与经纬度、年平均气温呈正相关关系。这是因为经纬度和海拔的梯度变化能够综合反映气温、降水和植被等环境因子的作用[44]。本研究中采样地海拔、土壤养分和温度等因子与‘凤丹’表型性状、蛋白质、含油率、棕榈酸和α-亚麻酸正相关程度较大，该结果与刘从等研究结果一致，认为植物体能够通过形态变化和养分形成来适应环境的改变，即形态可塑性[45]。出现这种情况一方面是受长期自然选择影响造成的自身遗传变异特性，另一方面是由各环境因子综合作用造成的主要营养成分含量变异[46]。

综上所述，四川盆地不同区域引种栽培的‘凤丹’种子表型性状及主要营养成分含量具有显著差异，气象、土壤养分和海拔等生态因子对‘凤丹’种子品质具有重要影响，在选择‘凤丹’种植基地时应充分考虑各地生态因子的差异，应选择海拔、温度较高，土壤养分(有机质、速效钾、有效磷、碱解氮)丰富的地区。