绒毛白蜡FvSAP1基因的克隆与分析及表达载体的构建

李 丽，臧真荣，燕丽萍，王因花，吴德军

（山东省林业科学研究院山东省林木遗传改良重点实验室，山东济南250014）

自然环境中非生物胁迫比如盐碱、干旱、低温等会影响植物的正常生长，植物往往通过抗逆相关基因的表达并经过体内一系列复杂的生理生化反应来抵御和适应外界环境的变化[1-2]，因此抗逆基因的表达是植物抵御外界不利因素、增强自身适应性的关键所在。许多研究证实植物抗逆基因的表达受某些锌指蛋白调控，且锌指蛋白发挥着重要作用[3]。因此可通过构建逆境相关锌指蛋白基因的植物表达载体，将基因转入植物体内，使其蛋白产物在逆境胁迫下过表达从而达到从分子水平提高植物抗逆性的目的。锌指蛋白序列中的组氨酸（His）与半胱氨酸（Cys）能和锌离子结合形成锌指结构，锌指结构与DNA 双链大沟或蛋白结合后参与基因表达的转录调控。TFIIIA 是首次发现的具有此功能的锌指蛋白[4]，随后人们发现各种动植物或其他物种体内存在锌指蛋白。根据蛋白中半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)的排列顺序，锌指蛋白被分成C2H2、C8、C6、C3HC4（RING 型）、C2HC 等类型[5]。本研究所克隆的锌指蛋白属于A20/AN1 型锌指蛋白，该蛋白具有A20或（和）AN1 型锌指结构。A20 锌指由一个或多个串联C2C2 锌指结构组成； AN1 锌指的结构模式是C-X4-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X- C 或者C-X2-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C，其中X 代表任意氨基酸[6]。OsSAP1（Oryza sativa subspecies indica stress-associated protein1）是在植物中首次发现的具有AN1 与A20 锌指结构域的蛋白，在烟草中过量表达OsSAP1 后，转基因烟草对逆境的耐受性得以提高[7]。后来有更多研究证明非生物胁迫应答与A20/AN1 锌指蛋白相关，因此具有A20/AN1 结构的蛋白被研究者命名为逆境相关蛋白SAPs（Stress associated proteins）[8]。

绒毛白蜡（Fraxinus velutina Torr.）为木樨科（Oleacear）白蜡属（Fraxinus L.）植物，原产美国，其树体高大，根系发达，抗逆性强，是盐碱地造林的主要树种，在城市绿化中应用也非常广泛。本研究以绒毛白蜡为材料，通过RT-PCR 技术克隆了含有两个AN1 锌指结构域的锌指蛋白FvSAP1 并对该基因以及编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析，同时构建了pCAMBIA2300-FvSAP1 植物表达载体，为下一步分析非生物胁迫下转FvSAP1 基因的株系与非转基因株系之间的表达差异，进而培育抗性强的绒毛白蜡新品种提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2018年在山东省林木遗传改良重点实验室进行，以绒毛白蜡(Fraxinus velutina Torr.) R36 的种子组培幼苗为材料。R36 为项目组在种质资源收集过程中于山东省东营市发现的优株。

1.2 绒毛白蜡总RNA 的提取及cDNA 第一链的合成

总RNA 提取采用Trizol 法，测定其OD260/OD280 值。取5 μL 样品，加1 μL 6×Loading buffer，用于1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量。用提取的总RNA 作为模板，按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 使用说明书合成的cDNA 第一链。

1.3 克隆绒毛白蜡FvSAP1 基因编码区

以绒毛白蜡转录组Unigene 数据为基础，该数据通过Illumina HiSeq 2000 高通量测序技术获得。设计引物序列如下F2:5′-CGGAAATGGGGAAGAACAG-3′; R2:5′-CAAACAAGAGGTCCGTCAT-3′，以F5、R5 为引物，cDNA 为模板，使用高保真酶对引物中间的蛋白质编码框进行扩增。扩增条件为：先94℃预变性5 min；再94℃变性30 s； 然后58℃退火30 s；最后72℃延伸1 min 30 s，共计30 个循环。把扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测完毕将目的条带回收、连接pMD18-T Vector 并把重组载体pMD18-T-FvSAP1 转化大肠杆菌DH5α。经过过夜培养后，选取单菌落进行PCR 扩增并筛选阳性克隆，在检测结果为阳性的菌液中加入15%的甘油在-80℃条件下保存，同时将新鲜菌液送到山东沃恩生物科技有限公司进行测序。

1.4 绒毛白蜡pCAMBIA2300-FvSAP1 植物表达载体的构建

提取重组质粒pMD18-T-FvSAP1，使用Xba I 和Sal I 对pMD18-T-FvSAP1 和pCAMBIA2300 质粒进行双酶切，凝胶电泳检测目的条带并回收。使用T4 DNA 连接酶将回收的目的基因和线性pCAMBIA2300 载体进行连接，将连接后的重组质粒pCAMBIA2300-FvSAP1 转化农杆菌LBA4404。过夜培养后选取单菌落进行PCR 扩增筛选阳性菌落。

1.5 生物信息学分析

利用ORFfinder 程序寻找开放阅读框； NCBI 上的CD-Search 工具查找氨基酸序列的保守结构域；BLASTX 程序进行核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性比对； DNAMAN 软件进行氨基酸序列的多重比较。

2 结果与分析

2.1 绒毛白蜡FvSAP1 基因编码区的克隆及植物表达载体的构建

本实验以绒毛白蜡幼嫩叶片反转录cDNA 为模板，通过设计特异性引物F2/R2 扩增得到大小为900bp左右的预期条带（见图1-A），对该条带进行回收、转化、阳性检测（见图1-B）、保菌并测序。

图1 PCR 扩增结果

对pMD18-T-FvSAP1 和pCAMBIA2300 质粒进行双酶切并使用T4 DNA 连接酶将目的基因与线性载体连接获得重组pCAMBIA2300-FvSAP1 质粒，且将重组质粒转化农杆菌LBA4404 获得重组质粒菌株。

2.2 生物信息学分析

2.2.1 氨基酸序列分析

基因编码区编码281 个氨基酸，分子量为31.0 kDa，等电点为8.34。使用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 上的Conserved Domains 数据库查询FvSAP1 蛋白序列的保守结构域，结构显示在13-47bp 和101-137bp 处各有1 个AN1 型锌指结构（见图2），其结构为：C-X4-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C。Jin 等把水稻、白杨等4 种植物中含AN1 锌指的蛋白家族分为两大类：类型Ⅰ的AN1 锌指基序为CX（2）CX（9-12）CX（1-2）CX（4）CX（2）HX（5）HXC，通常还含有A20 锌指结构域，基因内无内含子；类型II的锌指基序为CX（4）CX（9-12）CX（1-2）CX（4）CX（2）H X（5）HXC，不含A20 结构域，基因内有内含子[9]。说明所克隆的基因属于类型II。

图2 FvSAP1 基因编码区序列及氨基酸序列

2.2.2 同源性分析

Blast 工具寻找FvSAP1氨基酸序列的同源序列，结果显示与包含AN1 和C2H2 锌指结构的蛋白序列有较高的相似性。其中与芝麻(Sesamum indicum, XP_011075237.1) SiSAP16 序列的相似性为78%； 与烟草(Nicotiana attenuata, OIT39519.1)NaSAP16 序列的相似性为75%。选取相似性较高的几个序列以及查阅相关文献得知，同类的与抗逆境胁迫相关的蛋白番茄SlSAP12(Solanum lycopersicum,FJ442198)[10]，拟南芥AtSAP11(Arabidopsis thaliana, Q8VZ42)[11]，玉米ZmAN110(Zea mays, EF396223)进行多重序列比对（见图3）。从图中可以看出N-端的两个AN1 锌指结构域和C-端功能未知，类似C2H2 锌指的区域存在较高的保守性，说明不同物种之间，该蛋白序列的具有较高的保守性。

图3 FvSAP1 与同类蛋白的多重序列比对

3 结论

锌指蛋白属于基因表达调控因子，其重要作用就是调控基因的表达。已有多项研究显示植物体内的A20/AN1型锌指蛋白与植物应对逆境的反应有密切关系，人们将这种蛋白称为逆境相关蛋白SAPs（Stress associated proteins）。本研究从绒毛白蜡中克隆出了一个锌指蛋白基因FvSAP1，分析发现其编码蛋白序列中包含两个AN1型锌指结构域，属于A20/AN1型锌指蛋白，且与其他植物的同类锌指蛋白具有高度的保守性，并且构建了植物表达载体pCAMBIA2300-FvSAP1，为下一步验证该基因是否与逆境胁迫应答相关，以及培育优良抗性强的绒毛白蜡新品种奠定基础。