山东鸡爪绵核桃花粉形态的扫描电镜观察

唐贵敏，刘丙花，舒秀阁，梁 静，赵登超*，侯立群*

（1.山东英才学院，山东济南251400； 2.山东省林业科学研究院，山东济南250014）

山东省是我国核桃东部沿海分布区的主要产区之一，济南市南部山区是山东核桃主产区之一，其核桃栽培历史已有2 000 多年。目前在济南市历城区南部山区高尔镇、柳埠镇、仲宫镇、西营镇等地均保存大量的百年大树[1]，该地区典型的核桃品种资源为鸡爪绵核桃，其经历历代果农长期实生繁殖，座果率高，因结果枝形似鸡爪而得名。坚果品质优良，生长势、抗逆性强，在泰山山脉丘陵山地区大面积栽培，在农民增收致富、美丽乡村建设和乡村产业振兴中发挥了十分重要的作用。

花粉在植物的花粉囊中发育而成，其生长发育环境相对封闭，受外界环境影响小，为此其形态特征具有很强的遗传性，是研究植物物种演化和分类的重要依据[2]。国内外的许多学者对枣、油茶、樱桃、苹果等树种的花粉形态进行了观察，为其品种的分类鉴定、亲缘关系及其起源演化等提供了强有力的技术支持[3～5]。在核桃属植物研究方面，有对核桃科不同树种[6]、薄壳山核桃[7～8]和新疆早实核桃[9]花粉显微结构研究的相关报道，其研究结果为核桃或薄壳山核桃品种（系）的分类和鉴定提供了科学依据。目前，关于晚实核桃的花粉形态学研究较少，为此本文选取山东省南部山区特色地方品种‘鸡爪绵’核桃为试验材料，同时与早实核桃品种（系）进行对比分析，通过扫描电镜观测对比分析其花粉粒形态结构，分析其差异特征，旨在为山东省‘鸡爪绵’核桃种质资源的鉴定及分类提供孢粉学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验的核桃花粉来源于山东省济南市南部山区典型的鸡爪绵核桃优株和早实核桃品种（系）共5 份，其中鸡爪绵核桃为3 个优良株系（编号：GW1、GW2、GW3）、新疆早实核桃株系1 个（编号：XW1）和核桃品种‘绿香’。

1.2 试验方法

2020年3月—4月，于核桃雄花盛花期时采集带雄花核桃枝条，带回试验室后，将核桃枝条于水中进行培养，放置于硫酸纸上，待雄花序自然散粉后，收集花药，用pH=6.8 的戊二醛固定，并置于4℃冰箱保存、备用。

1.3 电子扫描显微镜观察

将样品从戊二醛固定液中取出，用0.1 M 磷酸缓冲液PB（pH 7.4）进行充分漂洗，1%的锇酸·0.1M 磷酸缓冲液PB（pH 7.4）室温（20℃）固定1～2 h，0.1 M 磷酸缓冲液PB（pH 7.4）再次漂洗，梯度乙醇进行脱水，脱水后放入临界点干燥仪内进行干燥，于导电碳膜双面胶上放入离子溅射仪样品台上进行喷金处理，使用SU3800 扫描电镜分别观察不同核桃花粉的形状、赤道面观和极面观特点以及萌发孔、外壁纹饰特点，并拍照。

1.4 数据统计与分析

1.4.1 花粉粒

随机选取20 粒花粉，进行测定分析，分析软件：Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville,MD, USA)。测量方法：应用Image-Pro Plus 6.0 软件以2.5K 20um 标尺为标准，每个样品共选取多个完整清晰的视野，分别测量其极轴长（μm）及赤道轴长（μm)（见图1），并计算极轴长与赤道轴长的比值（P/E，表示花粉形状），极轴长与赤道轴长的乘积(P×E，表示花粉的大小)[6]。结合电镜显微标尺长度计算其实际长度，用SPSS 20.0 软件进行统计分析。

图1 核桃花粉扫描电镜观测

根据王开发等人[10]对花粉形状类型的划分标准（见表1），对不同核桃花粉粒的形状进行分类。

表1 花粉形状的分类标准Table 1 Classification criteria of pollen shape

2 结果与分析

核桃花粉形态的扫描电镜观察结果（见图2图版A～E）所示，通过观察发现，本试验中鸡爪绵核桃和早实核桃花粉外观形态相似，花粉粒均以单粒的形式存在；核桃花粉表面均匀分布着颗粒状雕纹，且较为密集，萌发孔凸出于花粉表面。

图2 不同类型核桃花粉形态的扫面电镜观察结果Figure 2 Observation result of pollen morphology of different Walnuts by SEM

供试材料中，鸡爪绵核桃花粉的极轴长 （P）为31.15～32.73 μm，赤道轴长（E）为23.22～25.65 μm；‘绿香’核桃极轴长为32.05 μm，赤道轴长为26.47 μm；新疆早实核桃极轴长较小为30.35 μm，赤道轴长为24.30 μm，鸡爪绵核桃的花粉大小为760.19～801.19 μm2，新疆早实核桃为737.31 μm2，‘绿香’核桃最大为849.33 μm2，表2和表3方差分析结果表明，鸡爪绵核桃花粉与新疆早实、‘绿香’核桃的极轴、赤道轴和花粉粒大小无显著差异。

表2 不同类型核桃花粉特征值比较Table 2 Comparisons of the values of pollen morphological characteristics between different walnuts

表3 不同类型核桃花粉形态特征值的方差分析结果Table 3 Variance analysis of the values of pollen morphological characteristics of different walnuts

根据极轴/赤道轴(P/E)值确定不同核桃类型花粉粒的形状，试验材料中花粉(P/E)值在1.22～1.41 之间，依据王开发等人[10]对花粉形状类型的划分标准，确定试验材料中花粉形状类型均属于长球形。

3 讨论与结论

鸡爪绵核桃作为山东省特色地方品种，属于晚实核桃品种类型（嫁接后第4—5年开始结果）、抗病（黑斑病、炭疽病）性强，而新疆核桃表现为早实（嫁接后第2—3年开始结果）、丰产、易感病等特性，两个核桃类型在我国核桃产业发展中均做出突出的贡献。毛霞等[6]观察了核桃科植物的花粉，并根据花粉粒的大小对不同的进化进行分类，发现普通核桃花粉为单粒花粉，属于中等演化水平。刘壮壮等[7]研究不同薄壳山核桃品种花粉形态，发现不同无性系间体积差异表现显著，花粉粒形状均为扁球形，花粉表面呈颗粒状纹饰，均匀分布着颗粒状的突起，无性系间表面纹饰差异不明显。本试验中鸡爪绵核桃和新疆核桃花粉同是单粒花粉，方差分析结果显示鸡爪绵核桃间，并与早实核桃进行对比分析，其花粉大小差异不显著，且2 个类型核桃表面纹饰均为密集分布的颗粒状并分布在整个花粉表面，说明其的演化水平相当。

宁万军等[9]研究发现新疆早实核桃‘新新2 号’花粉粒性状为扁球形，其余为近球形，花粉极轴长度在33.55～41.68 μm，赤道轴长度在37.87～43.46 μm，本试验发现鸡爪绵核桃花粉的极轴长为31.15～32.73 μm，赤道轴长为23.22～25.65 μm；‘绿香’核桃极轴长为32.05 μm，赤道轴长为26.47 μm；新疆早实核桃单株极轴长较小为30.35 μm，赤道轴长为24.30 μm，其花粉形状均为长球形。对比宁万军的研究结果，新疆早实核桃在山东省栽培种植后，其花粉表现变小，可能是与品种（系）不同有关，但张延龙等[11]认为花粉粒大小可能与植物生长环境有关系，其花粉粒大小变化也可能是山东南部山区的气候条件和新疆地区的环境条件差异有关系，下一步可以通过对比分析同一品种的生长表现进行验证说明。