采用液相色谱法检测牛肉中五种磺胺类药物

任 展 黄建林 郝建格

（四川省汉源县农产品质量安全监督检验检测站，四川 汉源 625300）

农质发〔2014〕5号文件附件8《磺胺类药物在动物可食性组织中残留的高效液相色谱检测方法》指出该方法适用于猪肉中五种磺胺类药物（磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺喹恶啉）残留检测，为探究该方法的适用范围，本文在 方法定量限50μg/kg、最大残留限100μg/kg、2倍最大残留限200μg/kg三个浓度点进行三水平添加回收试验。采用多点溶剂外标和相邻浓度的基质标进行校准，并用相对响应值法来评价两种方式的定量结果差异，考查以牛肉为基质时的基质效应和方法的定量限、正确度、精密度能否满足 检测方法和NY/T 1896-2010《兽药残留实验室质量控制规范》的相关要求，以此评价能否运用该方法对牛肉组织样品中五种磺胺类物质进行检测。

本文的基质效应的评价方式为：基质效应（%）=B/A×100%，A:用溶剂标校准的回收量，B:用基质标校准的回收量。 当基质效应为90% ～110%时，则认为两种校正方式不存在显著差异，采用溶剂标进行校准；反之，则认基质效应对检测结果有显著影响，采用基质标进行校准。

1.试验方法

1.1 仪器、试剂和材料

仪器设备：Agilent 1260高效液相色谱仪（配紫外检测器）、华志HZT-A300百分之一电子天平、郑州长城科工贸R-1001VN旋转蒸发仪、固相萃取装置、蜀科TGL-17离心机、艾卡T18匀质器。

试剂耗材：乙腈（色谱纯）、 甲醇（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、冰乙酸（色谱纯）、正丙醇（色谱纯）、无水硫酸钠（分析纯）、电阻率为18.2MΩ的超纯水、体积比为95+5乙腈-水、体积分数70 %乙腈水溶液、CNWBOND碱性氧化铝柱（2g/10mL）、津腾尼龙微孔滤膜和针头过滤器（0.22μm）。

标准物质： 农业农村部环境保护科研监测所（天津）1mL、100μg/mL的磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺喹噁啉（SQ）、磺胺二甲氧哒嗪（SDM）。

1.2 标准曲线的制备

将所购置的标准物质溶液用甲醇稀释配制为10μg/mL的磺胺混合标准储备液，在-20℃以下冰箱中保存，有效期3个月。

溶剂五点外标：准确吸取五种磺胺类药物混合标准储备液，用流动相稀释成浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、 5.0 μg/mL系列混合标准工作溶液，由低浓度到高浓度供液相色谱仪测定。以峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

单点基质标：平行称取10个空白样品，经前处理后，得到约20mL混合基质溶液。准确吸取一定体积的5.0 μg/mL五种磺胺类药物混合标准工作液，用此基质溶液稀释成浓度为0.12μg/mL、0.25 μg/mL、0.5μg/mL的基质标准溶液。

1.3 前处理

提取：称取牛肉组织样品5（±0.05）g于50 mL塑料离心管中，加入15 mL乙腈和4 g无水硫酸钠，以10000 r/min的速度均质1 min后，用3000 r/min的速度离心5 min，将上层清液转移至另一离心管中；再在下层残渣中加入15 mL乙腈，涡旋混匀1 min后，以3000 r/min速度离心5 min，合并两次的上清液于同一离心管中，在此离心管中加10 mL正己烷，振荡5 min后进行离心分层，取下层液体至100 mL鸡心瓶中，并加入5 mL正丙醇，在50 ℃水浴下旋转蒸发至近干，加 95+5的乙腈-水3 mL，涡旋混合1 min，超声2 min，作为备用液。

净化：取 95+5的乙腈-水3 mL活化碱性氧化铝小柱，将上述备用液倒入碱性氧化铝柱中过柱，再用95+5的乙腈-水5 mL洗涤鸡心瓶后过柱，不收集；小柱内溶液完全流出后，用负压抽干小柱；用10 mL 70%乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液于100 mL鸡心瓶中；加入正丙醇5 mL后，用50 ℃水浴旋转蒸发至干，准确加入2.0 mL流动相溶解，涡旋1 min超声2 min，过0. 22 μm滤膜后，用高效液相色谱仪进行测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18，250mm×4.6mm（i.d.），粒径5μm；

流动相：甲醇-乙腈-水-冰醋酸（2+2+9+0.2）；

流速：1 mL/min；

进样量：20 μL；

柱温：30 ℃；

检测波长：270 nm。

2.试验结果

从色谱图可以看出（如图1、2、3、4、5所示），样品经前处理后，在五种磺胺目标物的出峰区域无干扰情况存在；五种磺胺类药物的峰形尖锐、对称性好、保留时间稳定，所有物质均能在17 min内完全流出分离。

图1 试剂空白色谱图

通过对基质效应的计算，牛肉基质对五种磺胺类药物的响应值影响不显著，故使用溶剂标对试验结果进行校准，并在此校准方式下对结果的正确度和精密度进行计算。以五种磺胺类药物的浓度（μg/mL，x）和相对应的响应值（峰面积，y）进行线性回归，线性方程如表1所示，相关系数r均大于0.999。在定量限、最大残留限量、2倍最大残留限量浓度水平下的检测结果如表2所示 ，五种磺胺类药物回收率在 70.6%～87.0%之间、相对标准偏差（RSD）在2.1%～8.8%之间，上述结果均符合此检测方法和NY/T 1896-2010中正确度（70%～110%）和精密度（RSD ≤ 15%）的要求。

通过对方法的选择性、基质效应、线性范围、定量限、精密度和正确度方法特性的验证，表明该方法同样适用于牛肉基质中五种磺胺类药物残留的检测。

图2 空白样品色谱图

图3 各组分浓度为0.25μg/mL的牛肉基质配标色谱图

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3.注意事项

使用该方法对牛肉中五种磺胺类药物进行检测属于超出标准规定范围使用标准方法，根据GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中允许方法偏离的规定，此种方式属于允许偏离标准方法的范围，但此方法偏离后应经实验室验证，编制偏离标准的作业指导书，经审核批准后方可使用。

试验中为保证回收率达到规定要求，在前处理过程中有几个关键点应需注意，否则回收率将会受到严重影响。在旋蒸过程中应注意对近干的控制，第一次旋蒸过干不利于磺胺类药物的复溶，会导致回收率降低；上样和洗脱时，应控制溶液过柱的流速（1mL/min为佳），过快的流速会导致回收率降低；碱性氧化铝柱的极性较强，在活化、上样中应严格控制各溶液中水分的比例，若水分比例过高，上样过程中会导致磺胺类药物从柱中直接流走，导致部分药物回收率过低甚至没有回收。