温阳生肌膏对糖尿病大鼠阴证慢性创面CD34和VEGF表达及血管重建的影响

张欢欢 唐金强 周忠志 史 瑄 黄湘宁 李 淼 曹海琳 侯铖宇 洪恺祺 陈 丽

（1. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

糖尿病慢性创面作为糖尿病常见并发症之一，中医辨证多属阴证，血管新生障碍是导致其经久难愈的主要原因。目前中医多采用中药汤剂内服结合创面外用药膏的方法治疗；现代医学采用包括纳米银、富血小板血浆和干细胞移植等方法治疗。但糖尿病慢性创面患者多因同时患有周围神经障碍、周围血管病变或者因创伤而导致创面迁延不愈，截肢率高，不仅对社会医疗资源及家庭财力造成负担，更影响患者的生存质量[1]。因此，探索糖尿病慢性创面经济有效的治疗方法是亟待解决的问题。温阳生肌膏治疗糖尿病阴证慢性创面临床取得明显疗效，但尚不足够清楚其作用机制。为此，我们观察了温阳生肌膏对糖尿病大鼠慢性创面的治疗效果及CD34、血管内皮生长因子（VEGF）和微血管密度（MVD）在其创面修复机制中所起的作用，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康SPF级SD雄性大鼠60只，5周龄，体质量180～220 g[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002]。实验全程对动物的处理符合文献[2]中动物伦理学标准的相关条例。大鼠于室温20～28 ℃、湿度45%～75%条件下饲养，每3只1笼，共20笼。实验期间大鼠自由饮水、饮食。高脂乳剂原料为丙硫氧嘧啶、胆酸钠（上海源叶生物科技有限公司）和1，2-丙二醇（湖南省天虹试剂有限公司）。温阳生肌膏，临床治疗糖尿病阴证疮疡的经验方，由丁香、肉桂、乳香、没药等配伍而成，湖南中医药大学第一附属医院周忠志主任医师研制，湖南中医药大学第一附属医院制剂中心生产，专利申请号201910743808.1。

1.2 实验方法

1.2.1 2型糖尿病阴证慢性创面大鼠模型制备 大鼠每日以2 mL高脂乳剂灌胃1次，连续14 d后，禁食不禁水16 h，腹腔注射质量体积分数为1%的链脲佐菌素溶液50 mg/kg（柠檬酸缓冲液溶解制成），72 h后尾静脉采血，连续3 d检测随机血糖浓度＞16.7 mmol/L为2型糖尿病模型制备成功[3]。于糖尿病模型大鼠股部外侧肌肉注射氢化可的松注射液20 mg/kg，每日1次，共3 d，可观察到实验大鼠出现较正常大鼠活动减少、喜蜷卧、体重减轻、四肢末端较凉、毛发枯糙等表现，符合2型糖尿病阴证大鼠体征。2型糖尿病阴证大鼠模型建立成功后，以3.5 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，在背部（腰椎正中偏上）两侧对称部位剃毛形成2个40 mm×40 mm正方形裸皮区域，消毒后用打孔器制成2个直径10 mm、深及筋膜层的圆形全层皮肤缺损。可肉眼观察到背部创面色泽晦暗，分泌物少而清稀，肉芽组织生长缓慢，且有正气不足和阳气虚衰表征，符合中医阴证疮疡辩证[4]。

1.2.2 动物分组与处理 将模型大鼠随机分为3组：模型组、实验组和对照组，每组20只，造模成功后次日开始给药。模型组创面不做任何处理；实验组创面外敷温阳生肌膏，均匀涂抹2 mm厚度，每日1次；对照组创面外敷象皮生肌膏，均匀涂抹2 mm厚度，每日1次。分别于3、7、14和21 d，取造模成功的大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，观察创面愈合率，并且背部创面组织取材。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 创面愈合率 对创面进行等焦距拍照，通过Image J图像分析软件测定拍摄创面的面积，计算创面愈合率。创面愈合率=（原始创面面积-观察时间点创面面积）/原始创面面积×100%。

1.3.2 组织病理学观察 治疗14 d大鼠背部皮肤创面取材，用不锈钢大头钉将取材的皮肤四个角平整固定于泡沫板上，待组织舒展后将其置于4%多聚甲醛中固定，脱水透明、浸蜡包埋，切片，苏木素-伊红（HE）染色，BA410E光学显微镜下观察。

1.3.3 免疫组化检测CD34和VEGF含量 于治疗7和14 d大鼠创面组织取材，用4%甲醛溶液浸泡一晚，石蜡包埋成块，组织切片，片厚4 μm。常规脱蜡，水化。CD34和VEGF的表达均采用免疫组织化学二步法，采用兔单克隆抗体VEGF、CD34一抗（英国Abcam公司）和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），二氨基联苯胺染色，苏木精复染，干燥后脱水、透明、封片，显微镜下观察：①VEGF：细胞质及细胞间质染色显示棕黄色颗粒为阳性。每张切片随机选择5个高倍镜下视野，用Motic Med 6.0图像分析软件分析阳性染色的吸光度值（A值），取平均值。②CD34：细胞质染色呈棕色的细胞为CD34阳性细胞，测定方法同VEGF。

1.3.4 MVD计数 每张切片沿肉芽组织基底部随机观察3个视野，采用Weidner计数法计数其中新生毛细血管数目及视野总面积，并计算MVD，取平均值。MVD=新生毛细血管数量/观察视野面积。

1.4 统计学处理 采用 SPSS.25.0 统计软件进行统计学分析，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 创面愈合的肉眼观察 ①模型组：造模后3 d，创面有少量脓液渗出，可见由创面周围向中心新生的肉芽组织；7 d，创面脓性分泌物明显减少，创缘开始收缩，创面面积减小；14 d，创面接近愈合，存在小面积的痂皮；21 d，创面面积缩小，但仍未完全愈合。②实验组：与模型组相比，造模后3 d，创面分泌物较少，新生肉芽组织较为丰富，覆盖创面；7 d，创面面积收缩情况较为明显，创面干燥，表面盖有薄层痂皮；14 d，创面明显收缩，状态良好，仅存少许痂皮；21 d，痂皮脱落，创面基本完全愈合。③对照组：与实验组相比，造模后3 d，对照组创周红肿，伴有少量渗血，创面整体晦暗有清稀脓液渗出；7 d，对照组创面面积收缩情况较实验组差，仍有少量组织液渗出；14 d，创缘收缩，薄痂布满创面；21 d，创面虽存少许痂皮，但基本愈合。可见，实验组较对照组促进创面愈合的效果显著。见图1(封二)。

2.2 创面愈合率 实验组与对照组各观察时间点创面愈合率均高于模型组（P＜0.05），且实验组显著高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠造模后不同时间创面愈合率的比较（, n=5, %）

表1 各组大鼠造模后不同时间创面愈合率的比较（, n=5, %）

注：与模型组比较：*P＜0.05；与对照组比较：▲P＜0.05

组别 造模后3 d 造模后7 d 造模后14 d 造模后21 d模型组 5.70±3.15 52.52±9.21 78.00±3.96 86.21±5.39实验组 7.34±2.70*▲ 64.62±8.12*▲ 92.44±3.93*▲ 96.75±2.29*▲对照组 7.01±4.99* 62.13±7.12* 83.05±5.06* 87.69±4.62*

2.3 病理学观察 造模后14 d，模型组创面成纤维细胞数量多，但仍有炎细胞浸润，血管生成少，细胞排列较紊乱，皮肤结构整体性低；实验组表皮层较为完整，炎细胞消退，组织细胞排列有序性高，胶原纤维排列整齐、交织成网，肉芽组织趋于成熟；对照组相较于实验组表皮层结构层次较为紊乱，胶原排列较疏松且不规则，伴炎细胞浸润于皮肤组织真皮层，成纤维细胞数目和毛细血管密度高于于模型组。见图2（封二）。

2.4 创面组织CD34及MVD的变化 造模后7 和14 d，实验组CD34表达水平均显著高于对照组（P＜0.05），模型组与对照组CD34表达水平无显著差异（P＞0.05）；造模后14 d实验组CD34表达水平显著高于模型组（P＜0.01）。见图3（封二）和图4。造模后3、7和14 d，实验组和对照组MVD显著高于模型组，且实验组显著高于对照组（P＜0.05），表明实验组新生血管密度增加。见表2。

图4 各组大鼠造模后7和14 d CD34表达水平的变化（n=5）

表2 各组大鼠造模后不同时间创面MVD变化（，n=5，×10-4 μm2）

表2 各组大鼠造模后不同时间创面MVD变化（，n=5，×10-4 μm2）

注：与模型组比较：*P＜0.05；与对照组比较：▲P＜0.05

组别 造模后3 d 造模后7 d 造模后14 d模型组 2.11±0.94 6.32±1.88 8.78±1.44实验组 4.21±0.94*▲ 9.83±1.84*▲ 10.53±2.11*▲对照组 4.04±0.79* 9.12±1.28* 9.83±1.09*

2.5 创面组织VEGF的变化 造模后7 d，实验组VEGF表达水平显著高于对照组（P＜0.05）；14 d时，实验组VEGF表达水平显著高于对照组和模型组（P＜0.05）。见图5。

图5 各组大鼠造模后7和14 d VEGF表达水平（n=5）

3 讨 论

针对糖尿病阴证创面迁延难愈、反复发作等难题，传统中医药价值巨大，亟待挖掘。糖尿病创面的难愈与神经、血管的损伤，长期慢性炎症、氧化应激损伤等有关[5-6]。中医认为，糖尿病创面可辩为阴阳两证，阳证创面属实热证，多由“气滞血瘀、郁阻经络、郁久化热”所致，表现为局部的红肿热痛，脓、腐等分泌物多，多治以“清热解毒、消肿止痛”；阴证创面则由于阳气虚衰、阴血不足而致迁延难愈，气血虚滞，无以化生，治疗上多以“温、补、消”为主[7]。温阳生肌膏在丁香、肉桂的基础上加入乳香和没药，起到温阳活血、祛腐生新的效果。温阳促气血运行，疮面恢复有化生之源，祛腐使邪毒有速去之道，使新肉能生。多年临床证实其对糖尿病创面疗效显著[8]。象皮生肌膏出自《疡科纲要》，用于创面治疗由来已久，本研究以其作为对照。

本实验采用高脂乳剂灌胃—腹腔注射链脲佐菌素—肌肉注射氢化可的松—手术除去背部皮肤的方法制备2型糖尿病阴证创面模型[9]。糖尿病创面愈合是一个多种机制参与的复杂而有序的过程，创面局部血管的新生贯穿整个愈合过程[10]。血管新生快、质量佳，便能够快速地形成血管网，增加血运，使营养物质能够及时、大量地输送至创面，为创面愈合提供“源动力”[11]。

本研究中，各时间点实验组与对照组创面愈合率均高于模型组，实验组愈合率显著高于对照组（P＜0.05）。病理学观察显示，造模后14 d，模型组创面成纤维细胞数量多，但仍有炎细胞浸润，血管生成少，细胞排列较紊乱，皮肤结构整体性低；实验组表皮层较为完整，炎细胞消退，组织细胞排列有序性高，胶原纤维排列整齐、交织成网，肉芽组织趋于成熟；相较于实验组，对照组表皮层结构层次较为紊乱，胶原排列较疏松且不规则，伴有炎细胞浸润，成纤维细胞数目和毛细血管含量高于模型组。Awal等[12]研究显示，CD34是血管内皮细胞上特定表达分子，表达CD34的血管内皮细胞增殖、迁移能力增强，具有内皮修复和血管重建等重要作用。造模后7、14 d，实验组CD34表达水平显著高于对照组，14 d时显著高于模型组；造模后3、7、14 d，实验组和对照组MVD高于模型组，并且实验组高于对照组（P均＜0.05）；表明温阳生肌膏新生血管密度增加效果强于象皮生肌膏。VEGF是血管生成的必要条件，可刺激血管内皮细胞增殖，诱导血管内皮细胞形成管腔样结构，从而促进血管新生[13]。本研究中，造模后7、14 d，实验组VEGF的表达水平上调，14 d时明显高于模型组和对照组，表明温阳生肌膏促进血管新生的效果较好，可为创面愈合提供有利微环境。

现代研究发现，温阳生肌膏的药物成分中丁香酚具有氧自由基清除作用，可降低机体氧化应激水平[14]；肉桂提取物肉桂醛通过抑制核因子-κB（NF-κB）通路的激活，改善持续的炎症反应，同时通过降低血管细胞黏附分子1的表达并诱导血红素氧合酶1的生成，改善局部缺血状态[15]。乳香中的11-羰基-β-乙酰乳香酸能上调CD34及VEGF；没药中Z-没药甾酮可上调内皮细胞DLL4蛋白的表达以促血管新生[16]。

本研究结果表明，温阳生肌膏通过上调CD34和VEGF表达促进内皮修复和血管新生，促进创面修复。今后将进一步探讨其对于创面结缔组织与肌肉重塑的具体机制，为临床合理应用提供科学依据。