锦鲫源豚鼠气单胞菌灭活疫苗的制备及免疫效果评价※

●魏代民 刘长宇，2 张 伟 李若铭 刘俊彤 张 建 单晓枫※※

（1.吉林农业大学动物科学技术学院 吉林 长春 130118；2.吉林省通化县人力资源与社会保障局 吉林 通化 134100；3.吉林省图们市农业农村局 吉林 延边 137200）

近年来，我国不仅对食用鱼类的需求稳步增加，对观赏性鱼类的需求也在逐渐提升，观赏性鱼类的养殖已成为水产经济的一个重要组成部分。锦鲫因体色鲜艳、食谱广泛、环境适应能力强等特点常被用于观赏鱼养殖[1]，但集约化、高密度的养殖模式以及水环境的管理不善等因素均会增加锦鲫感染各种细菌性疾病的风险[2]。

疫苗的预防接种对降低细菌性疾病发病率起到重要作用。灭活疫苗具有制备工艺简单、生产成本低、毒力弱、灭活效果稳定以及几乎不受母源抗体影响等优点，是目前市面上主流的免疫方式。本试验利用分离豚鼠气单胞菌AC-CY菌株，制备锦鲫源豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae，A.caviae）灭活疫苗，通过对锦鲫的免疫与攻毒试验，检测不同阶段的免疫指标对A.caviae灭活疫苗的免疫效果，以期为防控豚鼠气单胞菌引发的疾病提供一定理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株及试验动物豚鼠气单胞菌AC-CY菌株，分离自吉林省长春市某观赏鱼养殖场某患病锦鲫鱼。健康锦鲫鱼300尾（购自长春某鱼类养殖场），平均单体重（70±3）g。试验前在水箱中饲养14 d，观察健康状况。

1.1.2 试验主要试剂HRP标记的鱼补体4（C4）酶联免疫分析试剂盒，HRP标记的鱼补体3（C3）酶联免疫分析试剂盒，HRP标记的溶菌酶（LYS）酶联免疫分析试剂盒，HRP标记的免疫球蛋白M（IgM）酶联免疫分析试剂盒，HRP标记的碱性磷酸酶（AKP）酶联免疫分析试剂盒，均购自南京建成生物技术有限公司；EasyScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix RNA反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；甲醛购自广州某化工厂。

1.2 方法

1.2.1 灭活疫苗的制备将AC-CY菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养24 h后，将菌液浓度调至 1×107CFU/mL，将调好浓度的菌液按照菌液量分别加入0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%和0.5%的甲醛溶液，每种浓度3管，并将不同浓度的配制液放在4℃冰箱里灭活48 h，每隔6 h取100 μL均匀涂布于哥伦比亚绵羊血琼脂培养基、RS琼脂平板培养基及LB固体培养基上，同时设计不加甲醛溶液的阴性对照组。通过观察各组细菌的生长情况，发现最佳灭活条件为甲醛溶液浓度0.4%，灭活时间48 h，温度4℃。用PBS缓冲液将灭活疫苗离心清洗3次，封装到疫苗瓶中。

1.2.2 疫苗的免疫及保护率测定将300尾健康锦鲫随机分为2组，每组150尾，水温24℃，养殖周期为49 d。分别在0、7、14、28 d，灭活组每尾腹腔注射0.2 mL的灭活疫苗，PBS组注射同等剂量PBS。

在35 d进行攻毒试验，将AC-CY菌液（前期试验测定LD50= 2.51×102CFU/mL）过夜培养后浓度调至3×103CFU/mL，每尾注射0.2 mL，49 d时观察死亡情况，计算相对免疫保护率（RPS）。公式：RPS=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100%[3]。

1.2.3 锦鲫血清相关免疫指标检测分别在免疫前（0 d），第1次免疫后（7 d），第2次免疫后（14 d）、21 d、第3次免疫后（28 d）及攻毒试验（35 d），每组随机选取10尾进行麻醉后尾静脉取血，将血清置于-80℃冰箱内保存。利用ELISA法测定采集血清中的溶菌酶（LYS）、碱性磷酸酶（AKP）、鱼补体4（C4）、鱼补体3（C3）、免疫球蛋白M（IgM）含量。

1.2.4 实时荧光定量PCR的检测分别在免疫前（0 d），第1次免疫后（7 d），第2次免疫后（14 d）、21 d、第3次免疫后（28 d）及攻毒试验后（35 d），每组随机选取10尾锦鲫，分别进行麻醉采样，采集肝脏、脾脏、肾脏、肠和腮5个组织器官。在超净工作台中提取RNA。取一部分RNA进行浓度及完整性检测，剩余RNA按照反转录试剂盒进行反转录。

为评估免疫效力，试验通过（qRT-PCR）方法测定锦鲫各组织中IL-10、IL-1β、IFN-γ和TNF-α的相对表达量，引物序列详见表1，无cDNA模板设定作为阴性对照，参照样品为0 d，每个样品3个重复，内参基因为β-actin，反应 体 系：2×PerfertStartTMGreen qPCR SuperMix（Dye II）10 μL ，上 下 游 引 物 各0.5 μL ，cDNA 1 μL ，Nuclease-free Water 8 μL 。反应条件：50℃2 min、95℃ 30 s、95℃ 5 s、62℃ 30 s，共40个循环[4]。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.5 血清杀菌活性检测在第3次免疫后，灭活组及PBS组各随机挑取3尾，尾静脉麻醉后取血，分离出血清备用。将AC-CY菌株放入LB液体培养基中过夜培养，使用PBS缓冲液洗涤3次，浓度稀释至2×103CFU/mL后，取1 mL稀释的菌液与0.2 mL的血清混合均匀，分别在0、1、2、3、4 h取出100 μL混合液体，均匀涂布于RS琼脂平板培养基上，37℃培养24 h。依据每个时间段培养基上生长的细菌数，计算出每组的细菌存活指数（SI），测定各组血清杀菌水平。计算公式：

细菌存活指数（SI）=（取样时细菌数/0 h细菌数）×100%[5]。

1.2.6 白细胞吞噬试验将灭活组与PBS组在免疫前、第1次免疫后、第2次免疫后和第3次免疫后分别采血进行制片并染色，使用显微镜观察。随机观察100个白细胞，计算白细胞吞噬百分比（PP）以及白细胞吞噬指数（PI）[6]。计算公式：PP=（吞噬细菌的白细胞数/白细胞数）×100%PI=（100个白细胞吞噬的细菌总数）/100

2 结果与分析

2.1 血清免疫指标检测结果

由图1可见，灭活组在第1次免疫后，AKP浓度、LYS浓度、C3浓度和C4浓度不断上升，第2次免疫时浓度均达到此时免疫周期的峰值，21 d有所下降，第3次免疫后有所上升。在35 d攻毒试验后，所有浓度均达到整个免疫周期的峰值。PBS组无明显变化。

2.2 血清中IgM检测结果

如图2所示，经过注射AC-CY灭活疫苗的锦鲫可产生IgM抗体，且抗体水平显著（P＜0.001）高于PBS组，在第1次免疫后，其IgM抗体水平不断上升，第2次免疫时IgM抗体水平达到免疫时期最高值，IgM抗体水平在21 d有所下降，第3次免疫后有所上升，在35 d攻毒试验后，其IgM抗体水平达到免疫周期最高值。PBS组无明显变化。

2.3 实时荧光定量PCR检测结果

2.3.1 IL-1β基因相对表达量结果结果如图3所示，在整个养殖周期内灭活组IL-1β与PBS组均存在显著性差异（P＜0.001），经灭活疫苗接种免疫后，各脏器组织中IL-1β的相对表达水平升高，且随着免疫次数及时间的增加，各组织的IL-1β相对表达量均有提升；其中，免疫周期内（28 d）灭活组在14 d时肾脏表达量最高，攻毒试验后（35 d），PBS组和试验组的IL-1β表达量均上升，灭活组的表达量显著高于PBS组（P＜0.001）。以上结果表明，锦鲫接种灭活疫苗能提高各组织中IL-1β的相对表达量，增强炎性反应。

2.3.2 IFN-γ基因相对表达量结果结果如图4所示，与PBS组相比，灭活组在接种疫苗后IFN-γ的表达量在各个时期均为上调。在21 d各个组织中的IFN-γ表达量均有不同程度的下降，在第3次免疫后（28 d），表达量略有提升，其在14 d肾脏中的表达量最高。攻毒后，2组IFN-γ的表达量均升高，灭活组显著高于PBS组。

2.3.3 TNF-α基因相对表达量结果结果如图5所示，灭活组各组织的TNF-α表达量峰值均为第2次免疫后（14 d），在各组织中表达量最高为14 d的肾脏。

2.3.4 IL-10基因相对表达量结果结果如图6所示，各组织在免疫周期内免疫基因IL-10的表达量在14 d均为峰值，其中肠道的表达量是各组织中最高。整个免疫周期内，灭活组的IL-10表达量呈上升趋势；攻毒后，2组的IL-10表达量均有所升高，灭活组显著高于PBS组。

2.4 血清杀菌活性检测结果

在第3次免疫（28 d）后，试验组及PBS组随机挑取3尾，尾静脉麻醉后取血，同文中“1.2.5”方法收集血清。根据各时间段平板上生长的细菌数计算出每组的细菌存活指数（SI），判定各组血清杀菌水平。结果如表2所示，2组均有一定的杀菌能力，灭活组在4 h内细菌存活指数不断下降，最低达到37.47%；PBS组杀菌能力微弱，4 h内的SI分别为98.57%、96.75%、93.65%、94.52%和95.43%。

表2 细菌存活指数（SI） 单位：%

2.5 白细胞吞噬试验结果

2.5.1 白细胞吞噬百分比在显微镜下3次随机记录100个白细胞的吞噬情况，并根据计算公式计算3组平行试验的PP平均值，试验结果如图7所示。在0 d时，灭活组与PBS组的PP值分别为16.96%和17.40%，2组无显著差异，试验组在7 d上升到28.09%，14 d达到最大值48.56%，而21 d有所下降为35.99%，28 d回升至41.01%。PBS组在期间的PP值变化不显著。

2.5.2 白细胞吞噬指数在显微镜下3次随机记录100个白细胞的吞噬情况，并根据计算公式计算3组平行试验的PI平均值，试验结果如图8所示。灭活组与PBS组的PI值分别为1.94和2.52，2组几乎无差异。试验组PI值在7 d上升到2.52，14 d达到最大值3.62，而21 d有所下降为2.77，28 d回升至2.95。PBS组在期间的PI值变化不显著（P＞0.05）。

2.6 免疫保护试验结果

在养殖周期35 d后，对2组锦鲫进行攻毒试验，49 d后，观察死亡情况如9图所示，攻毒后，PBS组在7 d内全部死亡，灭活组RPS为77%。

3 讨论

由于灭活疫苗具有制备工艺简单、毒性小、效果明显等优点，是鱼类最主要的商品化水产疫病防控疫苗，且鱼类腹腔的注射方式效果也优于口服法与浸泡法[7]。研究表明，制备灭活疫苗的甲醛浓度、灭活时间、灭活温度对于其免疫效力影响极大，并且温度、时间、浓度的筛选均为越小越好，这样能最大化保留免疫抗原的效果，使免疫效果加强。张丹风等[8]制备的A. hydrophila灭活疫苗的最佳温度为4℃，此温度下A. hydrophila的灭活效果最佳，这与本研究结果一致。而潘吉脉[9]研究的A. hydrophila灭活疫苗最佳灭活温度为28℃，这与本研究结果不同，这可能是由于不同菌株的原因。本试验制备的AC-CY灭活疫苗采用甲醛进行灭活，摸索甲醛最佳制备灭活疫苗的浓度、时间及温度后，选取甲醛溶液最终浓度为0.4%，灭活时间为48 h，温度为4℃，可保留较好的免疫原性。

鱼的免疫系统分为特异性免疫及非特异性免疫，其中非特异性免疫是鱼抵挡外来病原菌至关重要的屏障，本试验对灭活组锦鲫与PBS组锦鲫都进行非特异性免疫指标的检测，用免疫指标的变化评价免疫效力。LYS广泛存在于许多生物体内，可使病原微生物细胞壁破裂达到溶解的作用[10]；AKP参与生命的钙、磷等代谢[11]，与生长发育密切相关，同时其浓度高低可用于肝胆等疾病的鉴别诊断[12]；C3和C4在补体经典激活途径中扮演重要角色[13]；IgM在病原微生物入侵机体时，可调控体液免疫的吞噬和免疫应答，其活力可表示机体免疫调节的能力，是硬骨鱼重要的免疫指标[14]。本试验结果表明，LYS、AKP、C3、C4和IgM的活性均有不同程度提高，AKP在攻毒试验后血清中含量显著升高，可能是AC-CY菌株进入机体刺激肝脏免疫分泌大量AKP的原因，其作用机制还有待于进一步研究；LYS、C3、C4活性的升高表明机体的非特异免疫能力被加强，疫苗对机体有保护作用；IgM是鱼类体液反应的特定组分，已有研究表明，注射疫苗可提升鱼类各脏器组织中IgM的活力，但表达强度与组织器官类型相关[15]。

机体受到刺激时，组织细胞（大多为免疫细胞）会分泌多种不同的细胞因子，以加强机体免疫能力。当病原体进入机体时，早期免疫反应为单核细胞经刺激分泌IL-1β激活巨噬细胞，巨噬细胞转录TNF-α[16]。本试验结果显示，灭活组各组织中IL-1β、TNF-α表达水平均有显著提升，在14 d时，肾脏IL-1β与TNF-α表达量为最高，推测AC-CY灭活疫苗作为抗原进入机体时，首先刺激肾脏的免疫系统调节。IFN-γ具有免疫调控的能力[17]。本试验结果表明，灭活组IFN-γ表达水平在免疫周期内迅速上升，第2次免疫后达到峰值，说明AC-CY灭活疫苗可能调节体内免疫水平，有一定的抗病毒能力。IL-10不仅参与细胞的生长与分化，同时还可调控炎性反应和免疫反应，从而抑制免疫炎症因子过多产生[18]。本试验IL-10表达水平的升高证明机体已开启免疫保护，抑制过多的炎性因子对机体造成损伤。

免疫保护试验的结果表明，免疫保护率为77%；血清杀菌试验也证明血清具有一定的杀菌能力，说明AC-CY灭活疫苗在抗豚鼠气单胞菌AC-CY感染的过程中具有良好的保护作用。

4 结论

本试验制备的AC-CY灭活疫苗通过非特异性免疫指标检测和qRT-PCR检测细胞因子等方法证明锦鲫的相关免疫指标均提高，锦鲫机体受到AC-CY菌株侵袭时有一定保护的能力。

攻毒试验证明，AC-CY灭活疫苗可以提高锦鲫抗豚鼠气单胞菌AC-CY感染的能力，降低死亡率，其保护率为77%。