山药 DoARID4基因克隆与表达特异性分析

王 琪，岳宁波，黄 鑫，闫见敏，李云洲

(贵州大学 农学院，贵阳 550025)

山药(DioscoreaoppositifoliaL.)属于薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)草质藤本植物，其块茎富含淀粉，可供蔬食，是中国重要的园艺蔬菜，此外山药含有丰富的多糖、氨基酸、皂苷、胆碱等成分[1]，还有减缓衰老和预防癌症等多种疾病的保健功能，因此具有极高的经济价值。

山药种植过程中经常发现畸形山药的产生，而畸形山药产生主要由于生长过程中遇到障碍物或由于物理原因造成伤口，而造成山药继续生长而产生畸形组织。除了外部环境是造成山药畸形的原因，另外，遗传因素也是山药畸形的主要原因，已有研究表明植物扁茎形成的主要原因是顶端分生组织异常，顶端分生组织的激增改变了器官原基的排列方式，并造成畸形形成[2-3]。富含AT互作结构域蛋白(The AT-rich interaction domain，ARID)在植物生长发育过程中发挥重要作用，目前已有研究表明，OsARID3调控水稻顶端分生组织的形成发育[4]。因此，探究ARID蛋白的功能，有望为畸形山药形成机制提供理论依据。

富含AT互作结构域蛋白(ARID)家族是一类广泛存在于真核生物中的DNA绑定蛋白[5-6]，前人对酵母、果蝇和哺乳动物的研究[7-9]表明ARID蛋白在许多生物过程起着至关重要的作用，包括胚胎发育和细胞周期调控[10]。关于植物ARID蛋白功能的研究非常有限。拟南芥中研究发现ARID1[11]和含有ARID-HMG双DNA结合域蛋白AtHMGB15[12]在精细胞形成和花粉管生长发挥重要作用。Hansen等[13]在拟南芥中鉴定出ARID-HMG1和ARID-HMG2，但其功能仍然未知。Zhu等[14]研究表明，ARID蛋白对于莲藕的藕节生长发育来说是必须。Xu等[4]研究表明OsARID3对于水稻茎尖分生组织发育是必须的。目前，关于山药ARID蛋白的序列和功能仍未见报道，因此，本试验以‘铁棍山药’为材料，依据NCBI网站公布的拟南芥AtARID1(AT2G46040.1)基因序列设计特异性引物，克隆出一条长731 bp的条带，将测序结果进行Blast比对，发现该基因与芋头、莲藕的ARID4序列相似性相对较高，因此将其命名为DoARID4，对其进行生物信息学分析，并利用q-PCR分析了DoARID4在山药不同组织中的表达特异性，为深入探究DoARID4在山药生长发育中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山药材料来自贵州大学农学院植物病理教研室，山药零余子经1.0% NaClO消毒后，用无菌水冲洗残留的NaClO，播种在灭菌的土壤中，营养钵育苗，置于人工智能光照培养箱(中国宁波东南仪器公司)进行培养：光照强度240 mol·m-2·s-1，光/暗：16 h/8 h，温度28 ℃/18 ℃(光/暗)，相对湿度70%。

1.2 RNA的提取

采用RNA提取试剂盒(RNA isolater Total RNA Extraction Reagent)提取植株总RNA，购买于南京诺维赞生物科技有限公司。提取山药茎、山药豆播种后5～6片叶片、10～12片时期的叶片总RNA，经过DNAase去除DNA后，经 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，NanoDrop One微量核酸浓度检测仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]检测其浓度。检测合格后的RNA用于反转录，通过反转录试剂盒(HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，购买于南京诺维赞生物科技有限公司)按照说明书操作反转录成cDNA，冻存于-80 ℃保存,备用。

1.3 DoARID4基因的克隆

根据NCBI网站公布的AtARID1(AT2G46040.1)基因序列，利用Primer Premier 5.0设计扩增引物DoARID4-F和DoARID4-R，以‘铁棍山药’反转录后的cDNA为模板，克隆DoARID4基因序列，使用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增，反应体系为：2 μL cDNA+1.5 μL F引物+1.5 μL R引物+15 μLTaqDNA Mix，ddH2O补齐到30.0 μL；PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，35个循环；72 ℃总延伸10 min。PCR产物送往北京诺赛基因组研究中心有限公司测序。DoARID4序列扩增所用引物见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 研究所用的PCR引物

1.4 DoARID4生物信息学分析

将测序得到的序列在NCBI数据库进行序列比对，DoARID4蛋白的理化性质分析通过Protparam网站(https://web.expasy.org/protparam/)进行，PSIPRED网站网站(https://swissmodel.expasy.org/)预测DoARID4蛋白三级结构，Softberry-Protcomp网站(http://www.softberry.com/)预测DoARID4蛋白亚细胞定位，TMHMM网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测DoARID4蛋白跨膜区，NetPhos 3.1网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测DoARID4蛋白磷酸化位点，SignalP5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽，使用DNAMAN软件对蛋白氨基酸序列进行推导，再用MEGA 7.0软件中的近邻相接法(neighbor-joining,NJ)(1000 Bootstrap)进行系统进化树 分析。

1.5 DoARID4基因的表达分析

DoARID4表达量检测采用BIO-RAD公司生产的CFX96TMReal-Time System荧光定量PCR仪进行。qPCR反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s)，40个循环；95 ℃ 10 s，65 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s；反应体系：10.0 μL荧光染料+0.5 μL F引物+0.5 μL R引物，ddH2O补齐到20.0 μL，每个样品设3个重复，以‘铁棍山药’的茎、叶为原材料，提取RNA反转录的cDNA模板，根据扩增的序列设计定量引物(表1)。以Actin基因为内参基因、qDoARID4为引物，检测DoARID4在铁棍山药不同组织中的相对表达量，采用公式2-△△CT分析计算基因相对表达量，Microsoft excel 2010处理数据，Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 DoARID4基因的克隆

以‘铁棍山药’嫩叶cDNA为模板，以表1中DoARID4为引物，进行RT-PCR扩增，获得一条长度为731 bp的条带(图1)，测序结果表明该基因开放阅读框为636 bp，编码 211个氨基酸。

2.2 DoARID4基因预测氨基酸的一级结构 分析

使用DNAMAN软件对蛋白氨基酸序列进行推导(图2)，利用Protparam网站对蛋白质的理化性质和氨基酸组成进行预测分析，结果显示：该蛋白的分子式为C1035H1606N304O305S17，氨基酸数211，理论分子质量为23.73 ku，等电点PI为8.32。带负电荷残基总数(Asp+Glu)21个，带正电荷残基总数(Arg+Lys)24个，总原子数为 3 267。该蛋白不稳定数值为40.57，预测其属于不稳定蛋白。脂肪系数为69.76，说明该蛋白有很强的脂溶性。

2.3 DoARID4蛋白疏水性/亲水性分析

用 Protscale 对DoARID4蛋白疏水性/亲水性在线分析，负值表示亲水，正值表示疏水(图3)，此蛋白的亲水性的平均值(GRAVY)为-0.440，多肽链第198位的精氨酸具有最低的分值(-2.533)，亲水性最强；第44位的亮氨酸具有最高的分值(1.400)，疏水性最强，从整体来看，由于负值较多，亲水性氨基酸分布在整个肽链中占比较高。因此，该蛋白为亲水性蛋白。

2.4 DoARID4蛋白磷酸化位点预测

利用NetPhos 3.1网站对DoARID4蛋白磷酸位点进行预测(图4)，结果显示，该蛋白预测含有14个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸位点7个；苏氨酸磷酸位点6个；酪氨酸磷酸位点1个。

2.5 DoARID4蛋白信号肽预测

通过Signal 4.0 Server 在线分析结果显示，DoARID4蛋白最高信号肽分值为0.16，其第26位丝氨酸残基可能是信号肽原始剪切位点，其最高剪切位点分值为0.115，从N端氨基酸开始到剪切位点处各氨基酸的平均信号肽分值为0.11，综合分析表明DoARID4蛋白无信号肽，不是分泌蛋白。

2.6 DoARID4蛋白亚细胞定位预测

利用PSORT网站分析该蛋白的亚细胞定位，结果显示，DoARID4蛋白存在于核中的可能性为34.8%，存在于线粒体中的可能性最大为52.5%。

2.7 DoARID4蛋白跨膜预测

用TMHMM 对DoARID4蛋白进行蛋白质跨膜区预测(图5)，预测结果显示DoARID4蛋白无跨膜结构域。

2.8 DoARID4基因预测氨基酸的二、三级结构分析

用PSIPRED对DoARID4蛋白的二级结构进行预测分析(图6)，在 DoARID4蛋白的二级结构中 α 螺旋占24.17%、延伸链占9.48%、无规则卷曲占66.35%，说明α 螺旋和无规则卷曲是DoARID4蛋白的主要结构部件，如图5。用 SWISS-MODEL 预测DoARID4蛋白的三级结构(图7)。

2.9 DoARID4同源性以及系统进化分析

将DoARID4蛋白序列和其他物种Arid蛋白用MEGA 7.0软件构建系统进化树(图8)，进化树分析显示：DoARID4与拟南芥Arid蛋白家族明显地分为两支，DoARID4和香芋ARID4亲缘关系较近。

2.10 山药 DoARID4在不同组织中的表达分析

为了分析DoARID4在不同组织中的表达模式，分别选取山药豆播种后新长出的新叶(未完全展开)、成熟叶(完全展开的功能叶)、地上茎、下地茎为材料，通过qRT-PCR技术分析DoARID4的组织特异性表达模式。结果显示：DoARID4基因的相对表达量在不同的组织间存在差异，在地上茎中的表达是最高的，在新叶中的表达量最低(图9)，推测山药DoARID4基因可能与其生长发育阶段，代谢活跃程度等存在密切关系。

3 讨 论

本研究发现‘铁棍山药’DoARID4基因在地上茎和地下茎中表达较高，而在叶片中表达较低，因为山药茎和根分裂活动比叶片强烈，推测DoARID4在山药茎和根发育中发挥重要作用，在将来的研究中需要通过转基因验证其功能。2019年河南师范大学李明军教授实验室建立了铁棍山药转基因体系，通过山药微茎块建立山药转基因再生体系[15]。但是目前仍未报道过关于山药转基因方面的试验，可能与山药再生能力有关。

植物再生能力由很多方面决定，除了植物本身的特性外，还有激素水平，另外就是基因决定。Xu等[4]研究水稻ARID3(OsARID3)功能发现该基因可以调控水稻再生体系，当水稻OsARID3通过T-DNA插入技术突变后，改变了水稻再生能力，另外，OsARID3突变株系生长素(IAA)含量升高，而OsARID3异戊烯基腺苷含量降低。笔者发现山药茎和根部DoARID4基因含量高，可能DoARID4参与调控山药茎和根的再生能力而影响畸形山药的产生，具体功能仍需进一步研究验证。

ARID蛋白普遍存在于真核生物中，是一个古老的DNA结合域[16]，其参与调控植物细胞的多种活动，在植物生长增殖、细胞分化、基因表达调控中都发挥重要作用。该蛋白家族在高等植物(单子叶植物和双子叶植物)以及低等植物(如藓类)中都是保守的。拟南芥基因组编码10个ARID蛋白，根据其C末端可分为4个亚家族。然而，这些ARID蛋白功能的研究鲜有报道，有关ARID蛋白的研究才刚起步。Roy等[17]对拟南芥ARID-HMG蛋白HMGB11的DNA-蛋白相互作用进行研究，结果发现其更喜欢富含AT的DNA作为底物，并显示超螺旋结构偏向。然而，Kortschak等[6]研究表明ARID蛋白的DNA结合活性不一定是序列特异性的，因此有关DoARID4蛋白的DNA结合特性还有待进一步研究。Xu等[4]研究发现OsARID3与水稻组培苗再生能力有关，其可以通过调控生长素合成基因OsYUC1，OsYUC6以及细胞分裂素合成基因OsIPT2，OsIPT7，改变愈伤组织中的激素水平，因此可以进一步探究ARID功能，为难以建立再生体系的植物提供新的思路。

‘铁棍山药’DoARID4蛋白是一类脂溶性很强的、非跨膜蛋白，可能分布于细胞核及线粒体中，可以通过丝氨酸或苏氨酸磷酸化识别细胞信号的传导功能，可能参与调控山药再生体能力而影响畸形山药的产生。