分子印迹的SiO2荧光探针制备及对儿茶酚的探测

孙文潭，程 燕，张 颍

(1 安徽皖欣环境科技有限公司,安徽 合肥 230000；2 合肥市环境监测中心站,安徽 合肥 230000)

儿茶酚常被用作染发剂、硬化剂、皮肤杀菌、电镀添加剂和照相显影剂等，是化工、医药和农药的中间体[1-2]。儿茶酚对人体呼吸道具有强烈的刺激性及致癌性，已被列入致癌物清单，因此，迫切需要寻求对儿茶酚的高选择性识别和高敏感探测的方法。目前检测儿茶酚的方法主要有高效液相色谱法、电化学法、固相萃取-高效液相色谱联用法及毛细管电泳-化学发光法[3-6]，尽管这些方法可以实现对儿茶酚的检测，但仍存在步骤繁琐、成本高昂、重现性差等缺点。传统分子印迹聚合物有着制备简单、稳定性好、可重复使用，且具有特异识别性、构效预定性和广泛实用性等优点[7]，但是缺点是有效识别位点少，结合量小，吸附速率慢，进入识别位点的目标分析物自身无信号输出。纳米材料表面印迹和识别位点功能化修饰可以解决传统分子印迹的缺点，已成为近年研究热点[8-12]。

本文将纳米合成、分子印迹技术与光诱导电子转移机理相结合，在SiO2纳米粒子的表面构建了荧光标记儿茶酚分子印迹的识别位点的探针，对其等温吸附量及选择性探讨，进一步利用其荧光特性与儿茶酚浓度关系作为信号输出实现了对儿茶酚高选择性识别和高敏感探测。

1 实 验

1.1 纳米二氧化硅的制备

首先将TEOS和适量的乙醇混合加入到500 mL带有磨口塞的三口圆底烧瓶中，用磁力搅拌器以固定转速500 rpm搅拌3 min，使TEOS与乙醇充分混合，然后将氨水迅速加入到上述反应液中，以750 rpm搅拌3 min后，再次将转速降至500 rpm，持续搅拌18～24 h，制得二氧化硅凝胶溶液。

1.2 二氧化硅纳米粒子表面儿茶酚分子的印迹

避光下，将2 mg NBD和1 mL APTS加入到15 mL无水乙醇中，超声分散5 min，放入振荡器中在室温下振荡20 h。将上述制备好的NBD-APTS溶液与上述制备的纳米SiO2凝胶溶液混合，避光条件下用磁力搅拌器以500 rpm搅拌24 h，得到NBD-APTS和氨丙基修饰的SiO2纳米粒子，将修饰后的SiO2纳米粒子平均分装在四支50 mL的离心管中，进行离心分离和溶剂的置换。分别用95%的乙醇和无水乙醇溶液依次离心、分散和置换3次。取上述10 mL NBD-NH2-SiO2纳米粒子溶液放入磨口的100 mL锥形瓶中，加入50 mL乙醇稀释，超声分散5 min后，加入30 mg儿茶酚、1 mL APTS、1.5 mL的TEOS和10 mg CTAB继续超声5 min，在磁力搅拌器上以350 rpm的转速反应10 h。非印迹的SiO2纳米粒子的制备与上述过程相同，仅未加儿茶酚。

1.3 洗脱处理

水解聚合反应后，离心分离印迹SiO2纳米粒子，用乙醇反复洗涤三次以去除溶胀剂及残余的有机单体等有机物，所得的印迹SiO2纳米粒子反复在体积比为8:1:1(甲醇/乙酸/乙腈)的混合液中回流以提取儿茶酚模板分子，直到提取液在278.5 nm左右无紫外吸收峰为止，再用乙醇洗涤去除残留的乙酸，然后在丙酮溶液中浸泡过夜，最后常温真空干燥至恒重，得到对儿茶酚特异性识别的NBD-NH2-SiO2纳米粒子荧光探针。

2 结果与讨论

图1 SiO2纳米粒子表面NBD标记的儿茶酚分子印迹识别位点的荧光探针的制备过程示意图Fig.1 Schematic illustration of a preparation process for the fluorescence probe of catechol molecules imprinted forming recognition sites labeled by NBD fluorescein on the SiO2 nanoparticle surface

图1说明具有高选择性识别和敏感探测的荧光标记儿茶酚分子印迹的纳米粒子的制备过程。1-2：NBD-APTS复合物、过量的硅烷化试剂APTS在SiO2的表面与羟基水解缩合反应，使得SiO2表面修饰上氨基和荧光残基基团(NBD-NH2-)；2-3：模板分子儿茶酚、功能单体APTS和交联剂TEOS通过水解缩合反应制备得到了在SiO2纳米粒子表面NBD标记的儿茶酚分子印迹识别位点的荧光探针，3-4：NBD荧光标记的儿茶酚分子印迹SiO2纳米通过洗脱模板分子儿茶酚后(荧光闭)与再结合(荧光开)，实现对目标分析物儿茶酚分子选择性识别和敏感性探测的过程。洗脱了在识别位点中的模板分子儿茶酚后，SiO2荧光探针的荧光强度变弱；当目标分子儿茶酚再次进入到识别位点后，探针的荧光强度增强，通过荧光强度的增强，实现对儿茶酚分子的选择性识别和敏感性探测。

图2说明的是用乙醇作为参比溶液，测得NBD、APTS和NBD-APTS的紫外可见吸收光谱。a，b和c线分别表示的是NBD、NBD-APTS和APTS紫外-可见吸收光谱。APTS和NBD反应后在可见区460 nm处出现了新的吸收峰，表明NBD-APTS复合物的生成。

图2 3种化合物在乙醇溶液中的紫外-可见吸收光谱图a，b和c线分别表示的是NBD、NBD-APTS和APTS紫外-可见吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectra of the three compounds in ethanol solution.The curve lines for a,b and c represent the UV-Vis absorption spectra of NBD,NBD-APTS and APTS,respectively

图3 荧光标记儿茶酚分子印迹的NBD-NH2-SiO2纳米粒子扫描电镜图Fig.3 SEM image of NBD-NH2-SiO2 nanoparticles imprinted with catechol molecules

图3是荧光标记儿茶酚分子印迹的NBD-NH2-SiO2纳米粒子的扫描电镜，所制备的SiO2纳米粒子表面修饰和儿茶酚印迹后仍为单分散球形纳米粒子，且表面较为光滑，粒径分布均匀，大小约200 nm。

图4 印迹材料对儿茶酚(a)和对苯二酚(b)，以及非印迹材料对儿茶酚(c)的吸附等温线Fig.4 The adsorption isotherm of imprinted materials to catechol (a)and hydroquinone(b)and non-imprinted materials to catechol(c),respectively

图4中印迹材料对儿茶酚的(a)和结构类似物对苯二酚等温吸附线(b)，以及非印迹材料对儿茶酚的等温吸附线(c)。选取与儿茶酚结构类似物的对苯二酚验证印迹材料的选择性。

从图4中可以看出儿茶酚在印迹聚合物微球上的最大平衡吸附量(约60.3 mg·g-1)为非印迹聚合物纳米粒子最大平衡吸附量(约26.8 mg·g-1)的2.26倍，是结构类似物的对苯二酚的2倍，说明儿茶酚印迹的聚合物纳米粒子对儿茶酚有较好的识别能力，这是因为制备儿茶酚印迹聚合物纳米粒子表面壳层中形成了与儿茶酚分子形状相匹配、大小合适和能相互作用的功能基团及空间骨架结构，从而使儿茶酚分子能够很好的进入结合位点，由于纳米壳层具有超薄的特点，使得儿茶酚目标分子更容易扩散到纳米壳层表面的印迹位点，因此，儿茶酚分子印迹材料拥有高的结合量。印迹材料对对苯二酚的最大平衡吸附量约为30.5 mg·g-1，其结合量是儿茶酚结合量的0.5倍，结果证实了印迹材料具有很高的选择性识别能力。

分别对图4中的印迹儿茶酚的纳米粒子对儿茶酚、结构类似物对苯二酚以及非印迹纳米粒子对儿茶酚实验热力学数据进行拟合，得到的结果如图5和表1所示。

图5 Langmuir(A)和Freundlich(B)模型热力学等温吸附拟合线：其中a和b线分别为印迹材料对儿茶酚和对苯二酚的等温吸附拟合线；c为非印迹材料对儿茶酚的等温吸附拟合线Fig.5 Fitting curves for thermodynamics isothermal adsorption of Langmuir and Freundlich model(A):a and b are the isothermal adsorption fitting curves of imprinted materials to catechol and hydroquinone,respectively,and c is the isothermal adsorption fitting curve of non-imprinted material to catechol

表1 热力学等温吸附模型拟合结果Table 1 Fitting results of thermodynamics isothermal adsorption model

从拟合结果来看，所制备的NBD-NH2-SiO2纳米粒子对儿茶酚、对苯二酚的等温吸附符合Langmuir模型，而非印迹NBD-NH2-SiO2纳米粒子对儿茶酚等温吸附也满足Langmuir模型，并且a、b、c在Langmuir模型中的R2分别为0.988、0.997及0.993，符合程度较高，属于单分子层吸附过程。

3 结 论

(1)利用光诱导电子转移机理制备出了儿茶酚印迹的NBD-NH2-SiO2纳米粒子荧光探针，该荧光探针的识别位点能够实现对儿茶酚产生特异性识别，进入识别位点的儿茶酚分子，使得NBD标记荧光基团的荧光强度的增强，从而实现了对儿茶酚的高敏感性检测。

(2)采用溶胶凝胶法成功的合成二氧化硅纳米粒子，其作为组装纳米结构分子印迹和荧光探针的支撑体；其次，二氧化硅纳米粒子表面后功能化，使其表面具有功能单体的诱导目标分析物富集作用，同时通过非共价键分子自组装印迹技术合成高选择性、高分散性的儿茶酚分子印迹聚合物纳米壳层。

(3)修饰在SiO2纳米粒子表面的氨基作为功能单体，儿茶酚为目标分析物，NBD作为荧光标记物，制备出了兼有分子识别和荧光信号输出的NBD-NH2-SiO2纳米粒子荧光探针。

(4)对制备的分子识别材料进行了热力学拟合，结果显示其符合Langmuir热力学吸附模型。