广藿香多酚类成分的提取工艺及其黄嘌呤酶抑制活性研究*

洪 玲，张远芳，许明媚，刘 芳

(湘南学院，湖南 郴州 423000)

广藿香(Pogostemoncablin(Blanco)Benth.)为唇形科雌蕊草属植物的地上干燥部分，广东的道地药材，“十大广药”之一，主产于广东、海南等地，植物资源丰富，是一种非常重要的传统中药。广藿香的活性成分是哪些呢？一直以来，广藿香研究的焦点主要集中在挥发油部分，随着研究的深入，发现广藿香非挥发油部分也具有较好的生物活性。课题组前期研究发现广藿香多酚类成分在某些方面较挥发油部分具有更好的生物活性，同时，文献调研也显示广藿香大极性成分具有较好生物活性，如Su-Young Park等[1]的研究表明广藿香水提物对TNBS诱导的UC有改善作用；广藿香水提物可以抑制因锌(Zn)不正常引起肠道绒毛损害[2]；任恒鑫等发现广藿香黄酮类化合物有可能是其治疗肠易激综合症的药效成分[3]；Kim EK等[4]发现广藿香黄酮类成分具有良好抗氧化和肝细胞保护作用。另外，2015版《中国药典》收录含广藿香的50余种成方制剂中，24种以药材磨粉制丸的形式入药，19种以药材水提液加水蒸汽蒸馏液的形式入药(即以水提物和挥发油成分共同入药)，1种(鼻炎康片)直接以药材水提液入药，仅有4种是直接以广藿香油入药，2种以乙醇浸出物入药，提示广藿香的药效成分不仅是挥发油成分，挥发油以外的成分也具有重要的地位。

广藿香药材中具有大量多酚类成分[5]，植物多酚类成分具有多种药理活性[6-8]如抗氧化、抗癌、抗病毒、抗心脑血管疾病、调血脂、抗炎等，但对广藿香多酚提取工艺、抗氧化作用及黄嘌呤氧化酶抑制活性等研究还未见报道。本文以多酚类成分得率为考察指标系统优化了从广藿香药材中提取多酚类成分，并对提取得到的多酚类成分进行了抗氧化作用和黄嘌呤氧化酶抑制作用进行了研究。为广藿香药材的进一步开发利用提供理论依据。

1 实 验

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料和试剂

本研究对象为广藿香，为河北金叶子药业有限公司所生产，产地为广东，批号190202C043。实验所用水为超纯水；DPPH标准品，优级纯，福州飞净生物科技有限公司；福林酚试剂，生物试剂，国药集团化学试剂有限公司；没食子酸，纯度99%，阿拉丁；无水乙醇，无水碳酸钠，水杨酸，硫酸亚铁，3%过氧化氢，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；黄嘌呤氧化酶，货号X1875-5UN，sigma；黄嘌呤，高级纯，萨恩化学技术上海有限公司。

1.1.2 仪 器

UV-9000型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；HWA-26电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；BSA223S电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；CS-10B高纯水发生仪，力辰科技；PTHW HEATER电热套，河南爱博特科技发展有限公司。

1.2 实验内容

1.2.1 没食子酸标准曲线的制作

精密称取没食子酸标准品11 mg于100 mL容量瓶，用水溶解并定容至刻度，得到浓度为0.11 mg/mL的标准液。分别准确吸取标准液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2以及3.6 mL置于50 mL的容量瓶中，以蒸馏水补至12.0 mL，加入福林酚试剂1.0 mL，充分混匀，在5 min内加入3.0 mL 20%的碳酸钠溶液，混合后用再用蒸馏水定容，50 ℃避光水浴20 min，以蒸馏水为空白对照，在760 nm下测定吸光值，每个样品平行测定3次。以没食子酸在反应体系中的浓度C(mg/mL)为横坐标，以对应的平均吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 广藿香多酚的提取方法与多酚含量的测定

取广藿香样品，密封备用。对乙醇体积分数(20%，30%，40%，50%，60%，70%)料液比(g/mL)(1:10，1:20，1:30，1:40，1:50，1:60，1:70)、提取时间(20，40，60，80，100，120，140 min)以及提取温度(30，40，50，60，70，80 ℃)这几个因素进行单因素试验。根据单因素试验的结果，选择乙醇体积分数、料液比、温度和时间为广藿香多酚的 4 个影响因素，每个因素设 3 个水平，采用 L9(34)正交表进行试验。称取广藿香样品5 g，放入圆底烧瓶瓶中，按上述单因素及正交试验设定的条件加入提取剂，放入电热套中，恒温冷凝回流提取一定时间，取出冷却，过滤，洗涤残渣，滤液合并定容至提取剂原体积。吸取提取液适量按“2.2”的方法测定，计算多酚得率：

多酚得率(mg/g)=c×V×n/m

式中：c 为样液多酚的质量浓度/(mg/mL)；V 为提取液体积/(mL)；n 为稀释倍数；m 为样品质量(g)。

1.2.3 广藿香多酚对 DPPH·自由基清除能力的测定

按最佳条件提取广藿香多酚，所得样液用于进行抗氧化试验。参照参考文献[9]的方法稍作修改，将0.1 mg/mL DPPH·的无水乙醇溶液 1 mL和样液 1 mL 混匀，室温下避光反30 min，在 517 nm 处测定吸光度。清除率按下式计算：

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%

式中：A1为样液与DPPH·溶液的吸光度；A2 为样液的吸光度；A3为 DPPH·溶液的吸光度。

1.2.4 广藿香多酚对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

实验设有B1、B2、B3、B4四组，每组所加试剂不同，具体所加试剂操作如表1所示。在加入黄嘌呤氧化酶后均需于 37 ℃水浴10 min，水浴结束后立即加入1 mL盐酸(1 mol/L)使反应终止，于290 nm处测定吸光度。

表1 抗黄嘌呤氧化酶实验试剂操作Table 1 Operation of antixanthine oxidase reagents (mL)

每个样品平行三次实验，计算平均吸光度代入酶抑制率公式：

酶抑制率=(1-(B1-B3)/(B2-B4))×100%

2 结果与讨论

2.1 没食子酸标准曲线

图1为没食子酸标准曲线图。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

没食子酸线性关系的考察：以没食子酸质量浓度c(mg/mL)为横坐标，对应平均吸光度值A为纵坐标，计算得线性回归方程为：y=89.5427x+0.0474，相关系数R2=0.99903在0.0018～0.008 mg/mL范围内，没食子酸质量浓度与其吸光度具有良好的线性关系。

2.2 广藿香多酚提取的单因素试验

2.2.1 料液比的影响

图2为料液比对广藿香多酚得率的影响图。

图2 料液比对广藿香多酚得率的影响图Fig.2 Effect of material liquid ratio on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由图2可以看出，料液比(g/mL)从 1:10 到 1:50，广藿香多酚的得率逐渐增加，说明增加溶剂用量有助于多酚类物质的溶出；但料液比继续增大，多酚得率反而稍微降低，说明多酚类物质已基本提取完全，继续增大溶剂反而会增大损耗。所以料液比确定为1:50。

2.2.2 乙醇体积分数的影响

图3为乙醇体积分数对广藿香多酚得率的影响图。

图3 乙醇体积分数对广藿香多酚得率的影响图Fig.3 Effect of the ratio of ethanol to water on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由图3可以看出，乙醇体积分数较低时，广藿香多酚的得率随乙醇体积分数增加而增大；当乙醇体积分数达到40%时，广藿香多酚的得率最高，随着乙醇体积分数再增大，得率逐渐降低。多酚是多羟基酚类化合物的混合物，不同的物质其多酚物质的组成不同，因而极性不同，需要选择与其极性相适应的溶剂使其溶出率最高。结果表明，乙醇体积分数为40%最适合提取广藿香多酚。

2.2.3 提取时间的影响

图4为提取时间对广藿香多酚得率的影响图。

图4 提取时间对广藿香多酚得率的影响图Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由图4可以看出，广藿香多酚的得率随时间的延长先升高降低，100 min时得率最高，可能是提取时间长会导致多酚类物质发生氧化等反应使其结构被破坏。后续试验选择提取时间为100 min。

2.2.4 提取温度的影响

图5为提取温度对广藿香多酚得率的影响图。

图5 提取温度对广藿香多酚得率的影响图Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由图5可以看出，随着温度的升高，广藿香多酚的得率先增加后逐渐降低，可能是温度越高，多酚物质越不稳定。在60 ℃时得率最高，所以选择提取温度为60 ℃。

2.3 正交试验

根据单因素的结果，设计L9(34)正交表，以广藿香多酚的提取率作为评价指标，进行正交试验，正交设计如表2所示，结果如表3所示。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factor level table of orthogonal experiment

表3 正交试验设计与结果Table 3 Orthogonal experimental design and results

根据单因素试验的结果进行正交试验，正交试验设计与结果见表 3。极差分析结果表明，料液比对广藿香多酚得率的影响较大，提取时间、乙醇体积分数和温度对广藿香多酚得率的影响依次减少，因素主次顺序为：B>D>A>C。根据正交表，从广藿香中提取多酚的最佳方案为：A3B3C3D2，即50%乙醇，料液比(g/mL)1:60，提取温度50 ℃，提取时间120 min，按此优化后的提取条件进行三次平行验证试验，广藿香多酚的得率为(10.652±0.06)mg/g。

2.4 广藿香多酚对 DPPH·自由基清除能力的测定

图6为广藿香多酚对 DPPH·自由基清除能力的测定。

表5 广藿香多酚对DPPH·自由基的清除能力Table 5 Scavenging ability of Pogostemon cablin polyphenols on DPPH radical

图6 广藿香多酚对 DPPH·自由基清除能力Fig.6 Scavenging ability of Pogostemon cablin polyphenols on DPPH radical

DPPH·自由基清除试验是评价天然产物抗氧化活性的一种常用方法。由图6可以看出，广藿香多酚能清除DPPH·自由基，且在试验质量浓度范围内对DPPH·自由基的清除能力都随质量浓度的升高逐渐增强，IC50=0.0064 mg/mL。

2.5 广藿香多酚对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

对含有不同浓度的广藿香多酚提取物(mg/mL)进行黄嘌呤氧化酶抑制实验，结果如图7所示，IC50=0.0224 mg/mL。

表6 广藿香多酚对黄嘌呤氧化酶的抑制作用Table 6 Inhibitory effect of Pogostemon cablin polyphenols on xanthine oxidase

图7 广藿香多酚对黄嘌呤氧化酶抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of Pogostemon cablin polyphenols on xanthine oxidase

3 结 论

黄嘌呤氧化酶的活性对体内尿酸的产生有至关重要的作用，核酸分解代谢过程中的中间产物黄嘌呤和次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下可氧化生成尿酸，随尿排出，因尿酸溶解度较小，体内过多时可形成尿路结石或痛风[10]。黄嘌呤氧化酶在氧化黄嘌呤时也产生过氧化物质。过氧化物是在代谢过程中产生的一类能损伤蛋白质、DNA、酶活性的物质，与炎症、衰老、退行性病变及肿瘤等病理过程有关[11]。抗氧化物通过抑制过氧化物的产生及及时转变过氧化物质而对机体发挥保护作用。抗氧化剂可通过测定还原力来表示抗氧化活性的强弱，抗氧化物质自身具有给出电子的能力，继而清除自由基发挥抗氧化作用，还原力越强，抗氧化性越强。

在我们的前期研究中发现广藿香水提物具有较好的黄嘌呤氧化酶抑制活性，经研究发现水提物中含有大量的酚酸类成分，推测广藿香酚酸类成分具有较强的黄嘌呤氧化酶抑制作用。为验证推测本文以多酚类成分得率为考察指标对广藿香进行提取工艺优化，得到的最优提取工艺为：在50 ℃的温度下，以50%乙醇为提取溶剂，料液比(g/mL)为1:60，提取时间为120 min时，广藿香多酚的得率最高为(10.652±0.06)mg/g。对采用优化后的提取工艺获得的广藿香多酚提取物进行黄嘌呤氧化酶抑制作用研究时显示广藿香多酚具有较好的黄嘌呤氧化酶抑制活性，其IC50=0.0224 mg/mL，验证了之前的推测，说明广藿香多酚可以通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性减少尿酸的形成而降低血中尿酸的含量，从而对痛风和痛风性关节炎产生有效的预防和治疗作用。同时实验显示广藿香多酚对DPPH·自由基具有较强的清除能力，最大清除率可达98.86%，可以减少炎症的发生及减少组织的损伤。总之，本研究为广藿香多酚预防和治疗痛风和痛风性关键炎奠定了扎实的实验基础，为广藿香药材的开发利用提供了研究方向。