樱花根癌农杆菌拮抗菌的筛选及功能分析

竺芊惠 胡霞 张宇鋆 王天康 邱琳凌

摘要：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种重要的革兰氏阴性植物病原细菌，几乎能侵染所有的双子叶植物引起根瘤。近年来，科学家们广泛筛选拮抗微生物来进行樱花根癌病的防治。本项目从樱花种植苗圃的发病植株根际微生物中，分离出了4株对根癌农杆菌At2有着抑菌效果的菌株，其中一株效果最为明显，将其命名为LW3。经形态学、生理生化指标初步鉴定其属于假单胞杆菌（Pseudomonas）。利用细菌16S rRNA基因序列分析发现，该菌与摩氏假单胞菌（P. mosselii CIP 105259T）高度同源。该菌的成功分离，为生产樱花根癌病拮抗菌提供了新的菌源，也为早期进行樱花根癌病的预防提供了可能。

关键词：根癌农杆菌;摩氏假单胞菌;拮抗菌;生物防治

1.引言

樱归属于李属（Prunus）下的樱桃亚属（Cerasus），其原产地主要分布在亚洲的中国、日本、韩国等地[1]。但在樱花繁育基地，一种土传病害-根癌病，正严重影响着樱花的生长，制约樱花产业的发展。相关文献表明，浙江省宁波市樱花主要栽培区平均发病率达30%，重发区块植株患病率甚至高达92%[2]。综上，樱花根癌病的早期预防是防治该病的关键手段。

生物防治中的拮抗菌预防，因其天然、无污染、效果好的优点，成为科研人员的研究对象。在根癌病的防治中，目前应用最广的是澳大利亚科学家Kerr分离的一种放射土壤杆菌K84，该菌能够产生核苷酸类细菌素，对根癌病的防治非常有效。当菌液浓度为106个/ml时，即可有效控制根癌病的发生[3]。K84的改造菌株K1026、WJK84-1能够成功的用于桃树等核果类果树根癌病的防治。

基于以上现状，本研究分别采集樱花种植苗圃土壤，从中筛选对致病根癌农杆菌具有拮抗作用的生防菌，得到一株具有较强抑菌活性的细菌LW3。通过生理生化以及分子生物学手段对其进行鉴定，判断其为摩氏假单胞菌，同时也对该菌进行了离体的拮抗作用分析，为根癌病防治的微生物菌肥生产提供资源。

2.材料与方法

2.1 土壤拮抗菌的分離及筛选

选取樱花根系附近的土壤，通过梯度稀释的方法进行稀释，获得单克隆。通过抑菌圈实验，进行拮抗作用分析，观察抑菌圈的产生并测量抑菌圈的直径。

2.2拮抗菌的鉴定

拮抗菌的鉴定分别从形态学、生理生化、分子生物学三个方面进行分析。形态学：利用透射电子显微镜下进行观察拍照。生理生化指标鉴定项目参考《常见细菌系统鉴定手册》。分子生物学鉴定利用细菌通用16S rRNA引物F8 / R1492进行PCR扩增。

3.结果与分析

3.1 拮抗菌的分离

通过抑菌圈实验测定，从根际细菌中筛选获得了一株拮抗菌，将其命名为LW3。该菌株对At2的抑菌圈直径在共培养4d后，抑菌圈的直径达到了51mm（图1a）。

3.2 拮抗菌的鉴定

菌株LW3在YEB培养基上菌落形态为圆形、光滑，颜色灰白色。革兰氏染色阴性，透射电镜观察显示，该菌具有极生鞭毛（图1b）。生理生化特征检测分析，该菌不能在4℃和42℃生长，氧化酶、水解酶阳性、好氧生长、硝酸盐还原阴性、柠檬酸盐利用阳性、可利用甘露醇、麦芽糖、木糖等碳源、不能水解DNA。根据该菌菌落特征以及生理生化指标，初步判断LW3为假单胞杆菌（Pseudomonas）。16S rRNA序列分析结果表明，菌株LW3与P. mosselii亲缘关系最近，因此，将该菌归为摩氏假单胞杆菌。

4. 讨论

目前，已有报道证明，摩氏假单胞杆菌对多种病原菌具有拮抗作用，拮抗范围涵盖人类、昆虫以及植物相关的病原菌。在这些研究中，仅有两例关于该菌对植物病原物的拮抗，一个是P. mosselii BS011菌株中的c-xtl基因簇被证明正调控水稻对稻瘟病菌的抗性，另外一个是通过转基因表达Ralstonia solanacearum ripAA基因，使P. mosselii产生了对烟草细菌性萎蔫病的抗性[4，5]。本研究从樱花土壤致病菌根癌农杆菌入手，筛选出来一株摩氏假单胞菌LW3，并证明该菌对致病根癌农杆菌的强烈抑菌作用，是之前尚未报道的。通过离体和活体实验证明，LW3通过抑制根癌农杆菌生长，从而降低其致病性来起作用。但是，该菌具体通过分泌哪种抑菌、抗菌物质来达到此效果，还需要进一步通过实验来证明。

参考文献：

[1] Li C L，Bruce B. Flora of China. Beijing：Science Press， 2003， 9： 404-420

[2] 王志龙，金杨唐，谭志文，王国良，林立. 宁波樱花根癌病病原细菌鉴定，植物保护， 2014，40（3）：147-150

[3] Kerra A. Biological control of crown gall through production of Agrocin 84. Plant Disease，1980， 64（1）， 25-30.

[4] Wu G， Liu L. A selective insecticidal protein from Pseudomonas mosselii for corn rootworm control. Plant Biotechnology Journal. 2018， 16：649-659

[5] Zhou T， Chen ST， Fan XJ， Hu X， Zou， HS. An improved control efficacy against tobacco bacterial wilt by an engineered Pseudomonas mosselii expressing the ripAA gene from phytopathogenic Ralstonia solanacearum. BioRxiv， 2019

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