维药神香草的质量控制研究

韩 雪 李 莉 刁娟娟

新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011

神香草为唇形科(Labiatae)神香草属(Hyssopus)硬尖神香HyssopuscuspidatusBoriss.的地上干燥部分,主要分布在新疆阿勒泰等地,是新疆地区习用草药。《维吾尔药志》记载其“性二级热，味苦、辛，气芳香，具有温肺平喘、祛寒止咳、燥湿祛痰、发汗解毒、消炎退肿的功效，用于湿寒性和黏液质性呼吸病[1]”。研究[2-4]报道，神香草中富含挥发油、三萜、黄酮、酚酸、多糖等成分，被广泛应用于维药、中成药中。临床上，神香草多为感冒、咳嗽药方中的主药或辅药，还被制成祛痰剂、发汗剂等[5]。

1999年《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》[6]收录神香草，其中包括了药材的外观性状、性味和功能主治等。该药材药用价值较高，但近年来药材购买市场较混乱，因为其极易与大苞荆芥混淆，所以建立质量控制的方法至关重要。前期已有学者对神香草和混淆品大苞荆芥进行了初步的质量标准研究[7],选用三萜类代表成分齐墩果酸与熊果酸作为指标成分。

神香草为本课题组所研究的中成药罗欧咳祖帕的主药，主要应用其抗炎、抗氧化、抗哮喘的功效，前期药效研究[8-16]表明酚酸类与黄酮类成分是抗炎、抗氧化的主要活性部位。根据相关文献[17]报道，酚酸类化合物迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗哮喘的功能，可通过改善内源性抗炎机制，抑制炎症细胞的释放，从而改善哮喘症状。黄酮类化合物蒙花苷具有抗菌消炎功能，而大苞荆芥未见文献报道黄酮类化合物蒙花苷的存在。因此本课题组选择酚酸类化合物迷迭香酸和黄酮类化合物蒙花苷为指标成分，对不同产地的神香草药材进行定性定量分析。目前，大多采用高效液相色谱法测定其含量，鲜有报道高效薄层扫描法对神香草中有效成分进行定量分析。高效薄层扫描法具有定性定量、操作快速、简单、成本低廉的优点[18-19]。本实验在对神香草进行质量控制的同时，并采用生态量表(ESA)对实验过程中环境友好程度进行对比分析[20-22]，以期为神香草中迷迭香酸和蒙花苷的质量控制和含量测定提供依据。

1 材料

1.1 药材与试剂 神香草采购自新疆和田地区，由新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为硬尖神香草。共有五批样品：S1(20110719), S2(1911044), S3(1909026), S4 (1910039)。生药学图片如图1所示。迷迭香酸(批号：111871-201706，中国食品药品研究院)；蒙花苷(批号：20210606，北京索莱宝科技有限公司)；乙腈(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)；甲醇，磷酸，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲酸(分析纯)；聚酰胺薄膜(20 cm×10 cm，浙江台州路桥四甲基生化塑料厂)。

图1 神香草地上干燥部分

1.2 仪器 高效液相色谱仪(日本岛津，LC-20AT)；TLC扫描仪3、Reprostar 3薄层色谱、Linomat5半自动点样仪均来自CAMAG(瑞士)；数控超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)；电子天平(AL104，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；分析天平(AB135-S，d=0.01/0.1mg，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)

1.3 高效液相色谱法

1.3.1 对照品溶液配制 精密称取迷迭香酸10 mg置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到迷迭香酸对照品储备液；精密称取蒙花苷5 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到蒙花苷对照品储备液。

1.3.2 供试品溶液配制 精密称定神香草粉末0.5 g(过筛)，置于具塞锥形瓶中，加入25 mL80%甲醇，称定其质量，超声(500 W、40 KHz)提取30 min，放冷后再称定质量用溶剂补足重量，合并滤液，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.3.3 高效液相色谱条件 色谱柱：Sepax HP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；等度洗脱：乙腈-0.1%磷酸(25∶75)；检测波长：330 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。如图2所示。

1.迷迭香酸； 2.蒙花苷图2 对照品及样品330 nm下高效液相色谱图

a 迷迭香酸 b 蒙花苷图3 混合对照品及样品330 nm下薄层扫描图

a 迷迭香酸 b 蒙花苷 S1-S4样品图4 对照品及样品366 nm下薄层色谱图

1.4 高效薄层扫描法

1.4.1 对照品溶液配制 精密吸取“1.3.1”项下对照品储备液经稀释分别得到迷迭香酸和蒙花苷对照品溶液。

1.4.2 供试品溶液制备 精密称定神香草粉末1.0 g(过筛)，置于具塞锥形瓶中，加入15 mL甲醇，称定其质量，超声(500 W、40 KHz)提取30 min，放冷后再称定质量用溶剂补足重量，合并滤液，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.4.3 薄层层析及薄层扫描条件 聚酰胺板(20 cm×10 cm)，条状点样，点样量为3 μL，试验前置110 ℃电热恒温鼓风干燥箱中活化20 min后，在干燥环境中放冷，以二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲酸=2∶5∶1为展开剂，双槽展开缸中饱和15 min，展开，取出，晾干，以2%三氯化铝溶液显色，105 ℃加热5 min，置于366 nm紫外灯下检视。在200～700 nm全波长下进行直线扫描检测，狭缝宽度为6 mm×0.3 mm，扫描速度为20 mm/min。使用了氘灯。测量供试品吸光度积分值和对照品吸光度积分值并计算。如图3～4所示。

2 方法与结果

2.1 线性范围 使用半自动点样仪分别吸取迷迭香酸和蒙花苷对照品溶液，以点样量0.5、1、1.5、2、2.5、3 μL分别点于聚酰胺板上，按照“1.4.3”项下的色谱条件展开、扫描。对照品储备液经倍半稀释法得到系列溶液。根据“1.3.3”项下的色谱条件下测定峰面积，以质量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程。见表1。

表1 标准曲线回归方程

2.2 精密度试验 将迷迭香酸和蒙花苷对照品溶液分别点在同一聚酰胺板上(2 μL,n=6)，按照“1.4.3”项下的色谱条件连续测定3 d。在3 d内，根据“1.3.3”项下的色谱条件，每天重复测定6次标准溶液。用相对标准偏差(RSD)计算了两种方法的日间和日间精度。见表2。

表2 精密度结果

2.3 稳定性试验 供试品溶液(1911044)点于在同一聚酰胺板上(3 μL,n= 6)，按照“1.4.3”项下的色谱条件展开。根据“1.3.3”项下的色谱条件，考察样品S2在0、2、4、6、8、12、24 h内的稳定性。两种方法的相对标准偏差(RSD)值计算。见表3。

表3 稳定性结果

2.4 重复性 精确称量同批次(1911044)样品6份，分别按照“1.3.2”和“1.4.2”项下的方法制备样品溶液，在“1.4.3”项下的色谱条件下，将样品溶液点在同一聚酰胺板上。根据“1.3.3”项下的色谱条件对供试品溶液进行检测。两种方法的相对标准偏差(RSD)小于3.00%，表明本方法重复性良好。

2.5 加样回收率 首先，分别按照“1.3.2”和“1.4.2”项下的方法平行制备供试溶液，测定迷迭香酸和蒙花苷的含量。将待测溶液按比例1∶1加入对照品溶液，按“1.4.3”项下色谱程序进行点样、显色、扫描。同样的供试品溶液按对照品0.5∶1∶1.5的比例加入，在“1.3.3”项下的色谱条件下用高效液相色谱法检测。计算两种方法的样品回收率和相对标准偏差(RSD)。见表4、5。

表4 HPLC加样回收率试验结果 (n=9)

表5 HPTLSC加样回收率试验结果 (n=9)

2.6 含量测定 在相应的色谱条件下，分别采用HPTLCS和HPLC法测定4批神香草中迷迭香酸和蒙花苷的含量，并计算不同方法测定的含量。对比两种方法测定神香草中迷迭香酸和蒙花苷的含量。见表6、7。

表6 HPLC与HPTLCS法测定神香草中2种成分含量结果比较

2.7 生态量表(ESA)分析 计算了两种方法分析的时间和试剂消耗。可以看出，采用HPTLCS检测神香草中迷迭香酸和蒙花苷的含量的时间和试剂消耗较少。见表7。根据PPs算法规则，对计算结果进行尺度排序，得分大于75代表绿色分析优秀，从75到50代表绿色分析可接受，小于50代表绿色分析不合格。结果表明，HPTLCS在分析生态尺度中得分较高。得分越高，说明该方法越环保、绿色。结果见表8。因此，可以看出HPTLCS是一种更经济、环保的分析技术。

表7 HPLC和HPTLCS法的时间和试剂消耗情况

表8 HPLC和HPTLCS法的PPs分析

3 讨论

3.1 指标物选择 通过药效追踪确定抗炎的有效部位为酚酸类和黄酮类，结合相关研究暂定以酚酸类化合物迷迭香酸和黄酮类化合物蒙花苷为指标成分，指标成分的选择与药效息息相关，采用不同类指标成分和不同检测方法对神香草进行更全面的质量评价和质量控制研究。

3.2 薄层板选择 本研究在薄层鉴别时最初选用高效硅胶板，考察了多个展开剂发现蒙花苷始终无法显色，由于蒙花苷是黄酮类成分，所以将硅胶板换为聚酰胺薄膜。在紫外366 nm下显黄色斑点。

3.3 混淆品鉴别 由于市场中药材较混乱，神香草购买过程中多次出现混淆品大苞荆芥，所以本研究在建立神香草质量标准的同时，以相同的色谱条件和相同的指标成分对混淆品大苞荆芥进行鉴别、分析，结果显示，与神香草相比，大苞荆芥中迷迭香酸含量较低，无黄酮类化合物蒙花苷，因此可以采用该方法区分神香草与混淆品大苞荆芥，为保证药材正确性提供参考价值。

3.4 不同方法比较 高效液相色谱法与高效薄层扫描法相比，前者灵敏度高、结果更准确、稳定，但样品制备较复杂，费用高；后者具有操作简单、迅速的特点，虽然灵敏度稍低，但高效薄层扫描法可作为一个简单、快速的质量控制方法。通过二者实验对比，期望对建立神香草质量标准提供后期实验依据。

综上，本研究所建立的神香草定性、定量方法具有简便、可行、重复性好的特点，可为快速鉴别神香草提供科学依据，为完善、建立质量标准奠定基础。