正交试验法优选玄参中肉桂酸的超声提取工艺

邓 莹 刘 杰 李 香 魏学军

黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000

玄参又名浙玄参、广玄参、元参，是玄参科植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，具有滋阴降火、解毒散结的功效，主要用于治疗热入营血、温毒发斑、热病伤阴、咽喉肿痛等症[1]。研究[2]表明玄参的化学成分主要为环烯醚萜类、苯丙素苷类、有机酸类等，其有机酸中的肉桂酸具有抗菌、消炎、利胆、轻泻等作用[3]，是玄参的生物活性成分之一。超声波提取具有提取效率高、时间短、溶剂消耗少、污染少、提取工艺温度低、能有效维持提取物的生物活性，且设备相对简单等特点，是一种新型环保提取技术[4]。为优化玄参中肉桂酸的超声提取工艺，本实验在单因素考察的基础上，采用L9(34)正交实验设计优化玄参肉桂酸超声提取工艺的甲醇浓度、液固比、提取时间、提取次数，旨在为玄参肉桂酸的提取工艺提供参考。

1 材料与试药

1. 1 试药 实验用玄参采于贵州省遵义市道真县中药材种植基地，经黔南民族医学高等专科学校中药教研室李香教授鉴定为玄参科植物玄参ScrophularianingpoensisHemsl. 的根。肉桂酸对照品(批号：CHB190106，成都克洛玛生物科技有限公司)。乙腈(色谱纯)；其他试剂均为分析纯。

1. 2 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司)；SG - 4050C数显恒温水浴锅(上海硕光公司)；AE240电子分析天平(瑞士MettLer公司)；AS10200A 超声波提取机(杭州汇尔公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水(40-60)；流速1 .0 mL/min；进样量10 μL；柱温25 ℃；检测波长285 nm。色谱图如图1所示。

图1 肉桂酸HPLC图

2.2 供试品溶液制备[3]精密称取玄参样品粉末约1.0 g，置于三角瓶中，准确移入30%甲醇50 mL，密塞称重，浸泡1 h，超声提取30 min，冷却后，用30%甲醇补足减失的质量，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 标准曲线绘制[3]制备质量浓度为1、2、5、10、15、20 μg/mL的肉桂酸对照品溶液，按照“2.1”色谱条件测肉桂酸峰面积。以对照品色谱峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)作线性回归，得肉桂酸线性回归方程为Y=867.8X-674.09(R2=0.9998)，表明肉桂酸在1～20 μg/mL内线性关系良好。

2.4 方法学考察 精密吸取0.1 mg/mL的肉桂酸对照品溶液10 μL，按“2.1”项下方法测定5次，测得峰面积的RSD值为0.14%。取“2.2”项下供试品溶液，在0、6、12、24、48 h测定，结果峰面积的RSD值为1.29%。取玄参药材粉末1.0 g，6份，精密称定，按上述“2.2”项方法制备供试液，测定峰面积，结果峰面积的RSD值为1.06%。取0.5 g含量为1.97 mg的玄参粉末6份，精密称定，每2份为一组，共为3组，各组中依次加入肉桂酸对照品0.98、1.97、2.96 mg，按“2.2”项制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件测定。结果见表1。

表1 加样回收率测定结果 (n=6)

2.5 样品含量测定 分别取3份玄参药材粉末，各1.0 g，精密称定，按“2.2”项下方法操作，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算玄参中肉桂酸的平均含量为(6.68±0.08)mg/g(n=3)。

2.6 单因素实验

2.6.1 甲醇浓度考察 精密称取玄参药材粉末约1.0 g，5份，分别加20%、30%、40%、50%、60%甲醇30 mL，超声提取20 min，提取1次，测定肉桂酸峰面积并计算含量，结果如图2所示。由图可知，肉桂酸含量随着甲醇浓度的增加而增加，当用40%甲醇作为提取溶剂时，肉桂酸含量最高，而用50%甲醇提取所得的肉桂酸含量反而下降，可能是因为随着甲醇浓度的增加，玄参中醇溶性物质溶出增多，与肉桂酸竞争溶剂，故选择40%甲醇作为提取溶剂。

图2 甲醇浓度对肉桂酸含量的影响

2.6.2 液固比考察 精密称取玄参药材粉末约1.0 g，5份，分别以40%甲醇10、20、30、40、50 mL超声提取20 min，提取1次，测定肉桂酸峰面积并计算含量，结果如图3所示，由图可知液固比为40∶1时所提取的肉桂酸含量已趋于稳定，与液固比为30∶1时差别不大，从节约溶剂的角度考虑，选择液固比为30∶1来进行工艺优化。

图3 液固比对肉桂酸含量的影响

2.6.3 超声提取时间考察 取玄参药材粉末约1.0 g，5份，精密称定，分别加40%甲醇30 mL后，分别超声提取10、20、30、40、50 min，提取1次，测定肉桂酸峰面积并计算含量，结果如图4所示，由图可知肉桂酸含量随着超声时间的延长而逐渐升高，但当超声40 min时肉桂酸的含量与超声30 min时无显著差异，可能是因为随着提取时间的增加，甲醇的挥发降低了甲醇的浓度影响了肉桂酸的溶出，从节约能源和提高效率的角度考虑，选择超声提取30 min来进行工艺优化。

图4 超声提取时间对肉桂酸含量的影响

2.6.4 提取次数考察 精密称取玄参药材粉末约1.0 g，4份，加入40%甲醇30 mL，超声30 min，分别提取1次、2次、3次、4次，测定肉桂酸峰面积并计算含量，结果如图5所示，由图可知提取至3次时肉桂酸含量已趋于稳定，从节约资源和时间的角度考虑选择提取3次来进行优化。

图5 提取次数对肉桂酸含量的影响

2.7 超声提取工艺优选 结合单因素考察结果，选取甲醇浓度(A)、液固比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)为影响因素，以玄参肉桂酸含量为评价指标，进行L9(34)正交试验设计，以直观分析和方差分析判断四个因素对玄参肉桂酸含量的影响，筛选最佳工艺。因素水平见表2，实验安排及结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素与水平

表3 正交实验安排表及结果

表4 方差分析

由表3中各因素极差大小可知，影响玄参肉桂酸含量的因素顺序为D>A>B>C，其中A因素和B因素的R值相同，以极差值最小的C因素作为误差项进行方差分析，由方差分析结果表4可知，4个影响因素对玄参肉桂酸含量均无显著性影响，因此结合K值，可选择最佳提取工艺为A1B1C2D3，即用30%甲醇作为提取溶剂，液固比为20∶1，超声提取3次，每次30 min。

2.8 验证试验 为进一步验证优选工艺的可行性，取玄参药材粉末1.0 g，3份，精密称定，按“2.7”项下优化的最佳提取工艺条件提取，即加入30%甲醇20 mL，超声提取3次，每次30 min，合并滤液定容至100 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算得玄参中肉桂酸的平均含量为(8.78±0.07)mg/g，与优选前“2.5”项下样品中肉桂酸含量相比较具显著性差异(P<0.01)，RSD=1.05%。结果表明优化的提取工艺科学合理、稳定可行。

3 讨论

根据肉桂酸的溶解性，试验选取了对人体相对安全的50%甲醇和50%乙醇来对玄参中的肉桂酸进行提取，结果发现用50%甲醇作为提取溶剂时，玄参中肉桂酸的提取率更高，因此试验中用的提取溶剂为甲醇。此外，本试验还比较了回流提取法和超声提取法对玄参肉桂酸含量的影响，结果发现超声提取法所得肉桂酸含量高于回流提取法，且超声提取法更省时、高效、节能。

肉桂酸具有轻泻作用，而滋阴是玄参的主要功效，因此肉桂酸在玄参中的含量密切关系着玄参药理作用的发挥[5]。对于玄参中肉桂酸的研究，文献中多见含量测定[6-8]，但玄参中肉桂酸提取工艺研究笔者尚未见国内外文献报到，为提高玄参中肉桂酸的提取率，本试验在预试验和单因素考察的基础上，采用正交试验对玄参中肉桂酸的超声提取工艺进行优化，并结合直观分析和方差分析，筛选出了科学、合理的最佳工艺。3次验证试验结果显示，优选出的工艺所提取的玄参肉桂酸含量较高，RSD小于1.5%。

综上，试验所得到的玄参中肉桂酸超声提取工艺稳定性好、专属性强，可为玄参中肉桂酸的提取和进一步开发利用提供参考。该优化工艺提取的肉桂酸对玄参药理药效作用的影响有待下一步深入研究。