miR-494对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的作用

张 雷，段广超，吴智辉

（商丘市第一人民医院脊柱外科，河南商丘 476100）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是一种间质瘤，通常发生于儿童和年轻人［1-3］。发病原因较为复杂，受遗传、表观遗传和生物学因素的影响［4］。OS患者的生存率仅为 15%～30%［5］。MicroRNA （miRNA）是非编码的内源性RNA，在基因组中具有高度的保守性［6］。已有文献报道miRNA的失调会参与影响OS和OS衍生细胞的进程［7］。miRNA（miR）-494已在多种类型的肿瘤中进行了研究，包括非小细胞肺癌、肝癌、胆管癌、胃癌和胰腺癌［8，9］。但是，miR-494的调节作用在不同肿瘤类型中具有不同作用。miR-494的异位表达会诱导OS细胞中G1/S期的停滞［10］。而先前研究表明细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）在G1/S期中发挥重要作用［11］，故本研究探讨了miR-494的表达情况对于OS的影响并进一步探究miR-494与CDK6在OS中的关联。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人骨肉瘤细胞株MG-63、U2OS细胞株购自中国科学院（中国上海）细胞库典藏中心。杜尔伯科改良伊戈尔（DMEM）培养基、α-MEM、胰蛋白酶、胎牛血清等均购自四季青公司，基质胶购自美国Sigma公司，细胞计数试剂盒（CCK-8）购自日本同仁化学公司，Transwell小室购自美国Corning公司，CDK6等抗体购自Abcam公司。

1.2 miR-494转染

细胞分组：MG-63细胞所使用的培养液为含有10%胎牛血清及100 U/ml青链霉素的DMEM培养液，在细胞培养箱内进行培养（37℃，5% CO2）。将处于对数生长期生长的细胞使用胰酶进行消化处理，然后分别接种于2个6孔板中，然后根据说明书分别将miRNA模拟物及miRNA对照链转染于MG-63细胞中。

1.3 检测指标

1.3.1 RT-PCR检测

实时定量PCR检测miR-494的表达情况。于细胞转染12、18以及24 h后，提取对照组、转染组细胞的总RNA，采用锐博公司试剂盒检测miR-494的表达水平，平行重复3次。

1.3.2 CCK-8 检测［12］

瞬时转染24 h后，将MG-63细胞接种到96孔板中，设置空白对照组，每组设置4个重复组，继续培养24、48、72 h后采用CCK-8检测细胞增殖情况。检测步骤如下：首先去除培养基，然后每孔加入10μl的CCK-8试剂，继续培养2 h，然后震荡混匀后采用酶标仪检测吸光光度值（450 nm波长），比较各组细胞增殖速度。

1.3.3 Transwell检测［13］

在孔中加入100μl的培养基，孵育10 min，使聚碳酸酯膜亲水。转染24 h后，使用胰蛋白酶消化，采用无血清的细胞培养以及重悬细胞，孔中各加入100μl的细胞悬浮液，下室中每孔加入500μl的有血清的培养基。置于细胞培养箱中培养12 h。之后，用多聚甲醛固定15 min，然后弃掉甲醛，放置晾干后用0.1%结晶紫溶液染色15 min，使用纯净水冲洗数次，晾干。于显微镜下（×200）选取10个视野进行细胞计算。采用划痕实验检测细胞的迁移能力。将转染后的细胞重悬，在新的6孔板中进行增殖，等到细胞融合率达到75%左右时，使用枪头划横线。之后使用1XPBS清洗3次去除划下的细胞，加入无血清培养基继续培养。在划痕结束的0、12 h时进行拍照，采用Image J软件进行测量距离，计算细胞的12 h的迁移情况。

1.3.4 Western blot检测

首先提取细胞总蛋白，然后采用SDS-PAGE胶进行电泳，待条带分离明显，进行转膜实验，将蛋白胶电转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。电压80 V，电转120 min后采用牛血清蛋白封闭1 h，过夜孵育一抗，之后使用TBST洗膜5次，之后孵育2抗1 h，再次TBST洗膜5次，然后使用化学发光法进行显影。曝光扫描条带，并采用Image J分析灰度值。进行3次独立重复实验。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，计数资料采用x2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-494检测

miR-494的RT-PCR检测结果见表1，随时间推移，两组miR-494的表达均显著增加（P<0.05），转染后12、18以及24 h时，转染组的miR-494表达情况均高于对照组（P<0.05）。

2.2 细胞增殖CCK-8检测

CCK-8检测MG-63细胞增殖情况见表1，随时间推移，两组细胞增殖均显著增加（P<0.05），24、48以及72 h时，转染组细胞增殖水平均显著低于对照组（P<0.05）。

2.3 Transwell侵袭和迁移能力比较

侵袭和迁移能力Transwell检测结果见表1，图1。转染组在视野下的平均细胞数、细胞跨膜数量以及细胞迁移率均显著低于对照组（P<0.05）。在两种细胞株中，均表现为转染组的侵袭和迁移能力弱于对照组。

图1 miR-494抑制细胞的侵袭和迁移能力 1a～1d:侵袭实验中，显微镜下观察到MG-63细胞以及U2OS细胞的图像1e～1h:迁移实验中，显微镜下观察到MG-63细胞以及U2OS细胞的图像

2.4 miR-494调控CDK-6的表达情况

使用RT-PCR对CDK6的mRNA进行定量比较，使用Western blot方法对CDK6进行检测比较，发现在转染组中，CDK6的mRNA以及蛋白表达均低于对照组，详情见表1、图2。在两种细胞株中，CDK6的mRNA水平均低于对照组。

表1 两组细胞检测结果（±s）与比较

表1 两组细胞检测结果（±s）与比较

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图2 CDK6表达情况 2a:CDK6在mRNA水平上表达情况 2b:Western blot检测CDK6在蛋白水平上表达情况

3 讨论

越来越多的证据表明，miR-494具有双重生物学功能：在某些特定肿瘤中高表达，又是某些肿瘤的抑癌药物［5］。据报道，miR-494在几种实体瘤中表达上调，包括肝细胞癌、急性粒细胞白血病、支气管癌变、视网膜母细胞瘤和结直肠癌［14］。通过靶向MCC及PTEN发挥致癌作用［15］。同时，miR-494在许多实体瘤中表达均下调，包括胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胆管癌［16］，并通过靶向IGF1R，Sirt1，C-myc，CXCR4及Bim等发挥肿瘤抑制作用［17］。然而，miR-494在骨肉瘤细胞中的生物学作用及其潜在机制仍不清楚。本研究采用两种常用的骨肉瘤细胞进行研究，结果表明过表达miR-494能够抑制骨肉瘤细胞的增殖。为了进一步探讨miR-494对于骨肉瘤细胞侵袭能力的影响，本研究进行Transwell实验以及划痕实验，在两种骨肉瘤细胞中，转染组的侵袭能力明显低于对照组，这表明过表达miR-494能够抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力，能够抑制骨肉瘤的侵袭扩散。

众所周知，miRNA通过抑制其靶基因发挥生物学活性。CDK6在细胞周期进程中至关重要，并且抑制CDK6将导致肿瘤细胞的增殖不受控制［18］。CDK6在几种类型的癌症中发现与疾病的进展具有相关性，包括胶质母细胞瘤和淋巴样恶性肿瘤［19］。CDK6在OS组织中明显上调，在不同恶性组织中进行了进一步研究表明［20］，CDK6的表达与肿瘤表型（转移和无转移）具有相关性，在转移性肿瘤中CDK6的表达升高。本研究中，过表达miR-494的骨肉瘤细胞的CDK6的表达降低，这可能提示miR-494与CDK6的表达存在相关性，进一步分析，miR-494可能靶向调节CDK6的表达，当miR-494过表达时，抑制了CDK6的表达水平。miR-494在OS中的作用可能由CDK6介导发挥作用。但是，确切的调控机理目前尚不清楚。

本研究确定了miR-494是OS细胞中的一种肿瘤抑制物miRNA，miR-494能够抑制骨肉瘤细胞的增殖能力和侵袭、迁移能力，其机制与调控靶基因CDK6有关，具体调控机理仍需进一步研究探索。