24孔板培养毕赤酵母GYW-1合成谷胱甘肽条件的优化

洪 伟,孙浩浩,王 洲

(1.芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖 241003；2.安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽芜湖 241000)

0 引言

谷胱甘肽(Glutathione ,GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸缩合而成的一种含γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽类化合物[1-3]，在蛋白质和DNA的合成、氨基酸的转运、细胞的保护过程中起着重要作用.同时，谷胱甘肽具有抗衰老、抗氧化和免疫调节活性[4-6].它主要分布于动物、植物、微生物细胞中，被广泛应用于临床医学、运动保健、食品加工等很多领域.因此GSH已成为各国科学家研究和探索的热点[7].

目前国内外生产谷胱甘肽的方法主要有萃取法、化学合成法、发酵法、酶法[8].由于发酵法生产GSH具有菌种易于培养、原料来源方便廉价、反应步骤简单、成本低、转化效率高、生产速率快等优点，已成为当前生产谷胱甘肽的主要方法[9].但目前微生物发酵法生产谷胱甘肽的产量较低，因此通过诱变提高微生物合成谷胱甘肽能力具有重要意义.现行常用的菌种选育方法是随机筛选法，即采用摇瓶逐个进行发酵培养并测定菌株的目标产量，该方法存在工作量大、周期长和成本高等缺点[10].高通量筛选技术目前在微生物制药领域有很多成功的应用[11-12]，同时微孔板具有孔板工作容积小，高度平行化，可同时发酵大量突变株的优势.因此，将高通量筛选技术应用于GSH高产菌株的筛选中，可缩短筛选周期，提高工作效率.在GSH高产菌株的高通量筛选中，通过优化发酵条件以达到接近摇瓶的产量可以减少筛选中的误差，提高筛选效率，为GSH高产菌株的选育奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试菌株毕赤酵母GYW-1由芜湖职业技术学院微生物实验室保藏.

1.2 实验试剂

培养基用酵母粉和胰蛋白胨，购自英国OXOID公司；还原型谷胱甘肽，购自国药集团化学试剂有限公司；DTNB标准品购自生工生物工程股份有限公司；其他常用试剂如无机盐和有机试剂等，购自国药集团化学试剂有限公司.

1.3 仪器与设备

FC型酶标仪：Thermo Fisher Sciencetific；紫外分光光度计，TU-1810：北京普析通用仪器有限责任公司；电子天平，TLE104E：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；722可见分光光度计，YK1109102：上海佑科仪器仪表有限公司；pH仪，EI20：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司.

1.4 实验方法

1.4.1 培养基的配制 A)固体培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，鱼粉蛋白胨20，琼脂18～22，用NaOH调pH至5.2～5.7.灭菌：115 ℃ 30 min.B)种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，鱼粉蛋白胨15，泡敌1，自然pH值.装量：50 mL/500 mL，灭菌：115 ℃ 30 min.C)发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉12.5，(NH4)2SO45，KH2PO49，MgSO4·7H2O 1.0, 用NaOH调pH至5.0～5.5.装量：50 mL/500 mL，灭菌：115 ℃ 30 min.

1.4.2 GSH的DTNB法测定 采用蒸馏水和产物GSH混合配制不同浓度的标样，然后在408 nm下通过酶标仪测值绘制标准曲线，同时用紫外分光光度计在408 nm下进行测定并绘制标准曲线.

1.4.3 菌株生长曲线的绘制 在无菌环境下用接种环挑取固体平板上长势良好的单菌落转接至装有新鲜种子培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于振荡恒温培养箱中，200 r/min、30 ℃条件下培养.以2 h为一个测定周期，取200 μL种子液用酶标仪在OD600条件下测定生物量，并绘制菌株生长曲线.

1.4.4 GSH的多孔板发酵培养基优化 A)24孔板与48孔板的比较:将各装有2 mL新鲜发酵培养基的24孔板和48孔板按10%的接种量接入活化后的新鲜种子液，同时放在温度为30℃、转速为200 r/min的摇床上发酵30 h.B)最适碳源、有机氮源、无机氮源的筛选:在培养基其它成分和配比不变的情况下，一个因素变化其他因素不变，即分别采用葡萄糖、蔗糖、乳糖、作为发酵培养基中的碳源；采用酵母粉、牛肉膏、蛋白胨作为培养基中的有机氮源；采用硫酸铵、氯化铵、柠檬酸铵作为培养基中的无机氮源.C)前体物质合成GSH的影响:在葡萄糖作为碳源、酵母粉作为有机氮源、柠檬酸铵作为无机氮源时，将L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种前体物质以不同的组合方式添加到发酵培养基.其他条件不变，研究不同前体物质对GSH产量的影响.D)最适葡萄糖、酵母粉、柠檬酸铵、甘氨酸浓度的选择:采取一个因素变化其他因素不变的原则，分别配制不同浓度的葡萄糖、酵母粉、柠檬酸铵、甘氨酸测定GSH含量，筛选出最适浓度.

1.4.5 GSH的多孔板发酵培养条件优化 A)装液量对24孔板发酵的影响:确定发酵培养基组分及配比之后，选择24孔板装液量分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，接种量10%，30 ℃、200 r/min摇床培养30 h，研究不同装液量对GSH产量的影响.B)接种量对24孔板发酵的影响:确定最佳装液量2.0 mL，选择24孔板接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%，30℃、200 r/min摇床培养30 h，研究不同接种量对GSH产量的影响.C)pH值对24孔板发酵的影响:配制pH值分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5五组新鲜的发酵培养基，其他条件不变，研究不同pH对GSH产量的影响.

1.4.6 正交实验设计 综合以上各因素对GSH产量的影响，选择A:酵母粉、B:柠檬酸铵、C:接种量三个影响较大的因素设计L9(33)正交实验.其中，酵母粉浓度的三个水平A1、A2、A3分别为36 g/L、44 g/L、52 g/L，柠檬酸铵浓度的三个水平B1、B2、B3分别是11、13、15 g/L，接种量的三个水平C1、C2、C3分别为12%、14%、16%.

2 结果与讨论

2.1 GSH含量的测定

分别使用分光光度计和酶标仪测定GSH含量都有很好的一致性，且采用酶标仪法不仅能节约试剂成本，而且还能够高通量检测，效率更高.所以选择酶标仪方法测定GSH含量.

2.2 菌株的生长曲线

菌株在200 r/min、30 ℃条件下摇瓶培养10 h左右开始进入对数生长期，在15 h左右开始进入稳定期，而在25 h左右开始进入衰亡期.根据不同生长期菌株的特点，即选择对数生长期的种子液用于接下来的孔板发酵.在接下来的种子液制备时培养10～15 h即可.

2.3 培养基条件优化

2.3.1 24孔板与48孔板的比较 由图1可以看出24孔板的发酵值明显高于48孔板，鉴于该株菌为好氧菌，24孔板与48孔板相比氧容量较高，因此以下实验均采用24孔板培养毕赤酵母GYW-1.

2.3.2 不同碳源及其浓度对酵母产GSH产量的影响 碳源是提供微生物生命活动中所需能源的原料，是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质，故碳源是需要量最大的营养物[13].

由图2可知，当以葡萄糖、蔗糖以及乳糖作为碳源时，GSH产量较高且相差不大，产量分别为35.111、33.444、29.185 mg/L.鉴于葡萄糖与蔗糖、乳糖相比经济实惠，并且葡萄糖可以直接经微生物发酵进入GSH的合成途径.综合考虑选用葡萄糖作为唯一碳源.以五组不同葡萄糖浓度进行GSH的发酵合成，其发酵液产量分别为29.494、30.111、32.457、29.494、29.988 mg/L，即当葡萄糖浓度为60 g/L时GSH产量最高.因此，确定发酵培养基葡萄糖最佳浓度为60 g/L.

图2 不同碳源及其浓度对酵母产GSH产量的影响

2.3.3 不同氮源及其浓度对酵母产GSH产量的影响 与碳源相似，氮源也是微生物的主要营养物，微生物可利用的氮源范围也十分广泛，可分为有机氮源和无机氮源两类[14].不同的微生物对氮源的要求差异较大.结果如图3和图4所示：

图3 不同有机氮源及其浓度对酵母产GSH产量的影响

图4 不同无机氮源及其浓度对酵母产GSH产量的影响

由图3可知，不同的有机氮源对GSH产量的影响差别较小.当有机氮源为酵母粉时GSH产量较高，为34.432 mg/L.再以五组不同酵母粉浓度的发酵液进行GSH合成，GSH产量分别为30.296、30.667、33.444、37.519、36.963 mg/L，即当酵母粉浓度为40 g/L时GSH产量最高.因此，确定发酵培养基酵母粉最佳浓度为40 g/L.

由图4可知，当无机氮源为柠檬酸铵时产量较高，为38.877 mg/L.综合考虑采用柠檬酸铵作为无机氮源进行接下来的实验.以五组不同柠檬酸铵浓度进行GSH发酵，其产量分别为27.889、32.148、34.370、30.667、30.481 mg/L，即当酵母粉浓度为12 g/L时GSH产量最高.因此，确定发酵培养基柠檬酸铵最佳浓度为12 g/L.

2.3.4 不同前体物质及其浓度对GSH合成的影响 谷胱甘肽的合成依赖其前体物质在培养基中的含量[15]，因此将L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种前体物质以不同的组合方式添加到发酵培养基，考察其对GSH合成的影响.

由图5可知，当单独添加三种前体物质时，GSH产量相较于未添加前体物质时都有所提高，并且甘氨酸的影响最大.而把三种前体物质进行不同组合再添加时，GSH产量相较于未添加前体物质时都有明显的降低.因此，选择添加甘氨酸一种前体物质进行GSH发酵合成.再以五组不同甘氨酸浓度进行发酵生产，GSH产量分别为53.815、59.185、50.481、46.407、43.815 mg/L，即当甘氨酸浓度为1.5 g/L时GSH产量最高.因此，确定发酵培养基甘氨酸最佳浓度为1.5 g/L.

图5 不同前体物质及其浓度对酵母产GSH的影响

2.4 发酵培养条件对GSH合成的影响

2.4.1 装液量对24孔板发酵产GSH的影响 五组不同装液量的发酵液产量分别为18.074、38.444、39.741、26.222、21.778 mg/L，即当装液量为2.0 mL时GSH产量最高.因此，确定24孔板发酵培养基装液量为2.0 mL.

2.4.2 接种量对24孔板发酵产GSH的影响 由图6可知，五组不同接种量的GSH产量分别为21.963、26.593、25.852、39.185、40.481 mg/L，即当接种量为10%时GSH产量最高.因此，确定24孔板发酵培养基接种量为10%.

图6 不同接种量对GSH产量的影响

2.4.3 pH值对24孔板发酵产GSH的影响 5组不同pH的GSH产量分别为32.148、25.481、36.963、45.296、45.296、41.778 mg/L，即当发酵培养基pH为5.5和6.0时GSH产量最高.因此，确定24孔板发酵培养基pH为5.5～6.0.

2.5 正交实验设计

在明确了影响酵母产谷胱甘肽含量的单因素的基础上，分别选取对GSH产量影响较大的因素，即酵母粉浓度、柠檬酸铵浓度以及接种量三个因素进行三因素三水平正交实验，以考察分析其中对谷胱甘肽合成影响的关键因素，并对谷胱甘肽合成的最适培养基组成进行分析.

由表1可知，九组不同的水平组合中，以水平组合为A2B3C1时，GSH产量最高.从而确定发酵培养基最适组成为：葡萄糖60 g/L，酵母粉44 g/L，柠檬酸铵15 g/L，KH2PO49 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L、甘氨酸1.5 g/L，pH5.5～6.0.最适培养条件为：装液量2.0 mL、接种量12%、30 ℃、200 r/min摇床发酵30 h.

表1 正交试验结果与分析

3 结论

本文对所建立的24孔板发酵方法进行培养基和培养条件优化，以期获得最优的发酵条件.其中，在进行培养基优化时，通过单因素实验及正交实验，确定最佳发酵培养基为葡萄糖60 g/L，酵母粉44 g/L，柠檬酸铵15 g/L，KH2PO49 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L、甘氨酸1.5 g/L，pH5.5～6.0.在进行发酵条件优化时，确定了装液量2.0 mL、接种量12%，30 ℃、200 r/min摇床发酵30 h.在此优化条件下的GSH产量达到43.815 mg/L.优化后得到的GSH的含量相对于优化前在原始培养基的GSH含量増加了55%.