雨生红球藻藻种改良趋势及育种研究进展

徐晓莹，黄华，陈坤，徐惠章，史文凯，张金浩，王鹤

（烟台市海洋经济研究院，山东 烟台 264000）

雨生红球藻Haematococcus pluvialis 属绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属，是自然界中虾青素含量最高的生物[1,2]，已被广泛应用于水产和家畜、禽养殖、医药、食品、化妆品等领域。利用雨生红球藻生产天然虾青素已成为高值经济微藻技术研发的热点。但雨生红球藻培育条件要求高，易被其他微藻、杂菌污染，生长缓慢，培养周期长。因此，筛选生长速率快、虾青素含量高的雨生红球藻株是亟待解决的问题。本文主要概述了雨生红球藻育种研究现状，并展望其应用前景。

1 雨生红球藻的藻种改良趋势

与大部分微藻不同，雨生红球藻具有游动细胞和不动细胞等多形态交互变化的生活史特征，并受培养基组成和环境条件的影响。从游动细胞向不动细胞的转变过程通常伴随着虾青素的不断积累，因此,近年来有关雨生红球藻的研究主要集中在虾青素的诱导因素及其相关代谢与调控机制[3-8]。雨生红球藻生长缓慢，培养条件要求高，细胞难以进行高密度培养。目前商业化生产的雨生红球藻，基本上都是采用传统光自养方式，即在开放式跑道池或各类光生物反应器中进行。光自养方式产率低，对室外光照条件要求高，收获物的培养密度也不高，一般仅为1～3 g·L-1[9,10]。这直接造成了雨生红球藻藻粉的供应远不能满足下游虾青素生产加工产业的需求。

除了光自养的生长方式外，也尝试通过异养或混养的方式培养雨生红球藻，迄今已证明，乙酸钠是雨生红球藻最有效的有机碳源[11-13]。Hata 等[14]通过分批补料添加乙酸钠的方式使雨生红球藻细胞培养密度达到7 g·L-1；Wan 等[15]报道，雨生红球藻的异养培养密度可达26 g·L-1，生物量产率达64.1 mg·L-1·h-1。这表明雨生红球藻的异养或混养培养方式可有效提高雨生红球藻的生物量产出，降低生产成本。

异养雨生红球藻的生长优势强于自养方式，可获得高密度培养物，但是，雨生红球藻的异养培养仍存在明显的缺陷。首先，生长速率较低。乙酸对细胞生长起抑制作用，在传统微生物发酵中乙酸一般是作为一种不利的副产物，以乙酸为底物的发酵过程一般效率较低。Hata 等[14]和Wan 等[15]的研究中都采用pH 调控的方式进行补料，控制体系浓度与添加量。他们都发现乙酸并不利于雨生红球藻游动营养细胞的繁殖，这导致细胞的生长速率低，为获得高密度培养物往往需要长时间培养。

其次，异养过程也不利于虾青素积累。有研究证明：异养生长的虾青素积累效率远低于光自养诱导条件[16]。为提高细胞积累虾青素的效率，Hata 等[14]通过强光诱导后，单虾青素产率为4.4 mg·L-1·d-1，并不高于自养过程的6.3 mg·L-1·d-1。Wan 等[15]则通过细胞稀释、光自养培养以及光诱导虾青素积累的三步过程，实现了6.4 mg·L-1·d-1的虾青素产率，持平于自养过程。但是，这种方式并未跳过传统二步法的雨生红球藻虾青素生产过程。因此，雨生红球藻异养生长能力仍然有待改善，获得具有更高异养细胞生长速率、能够利用糖类等更多碳源底物的高效诱导积累虾青素优良藻株，可能是未来藻种异养性状改良较有发展潜力的研究方向。

2 雨生红球藻的育种研究现状

为进一步促进雨生红球藻的商业化应用，提高产品价值和产业效益，选择适应能力强、生长繁殖快的高产优质雨生红球藻是努力方向。

2.1 选择育种

选择育种是利用现有种类通过驯化与自然选择而育成新品种。这种育种方法简单易行、安全性好。张宝玉等[17]通过自然选育的方式，比较分析了四个品系的雨生红球藻在不同温度下的生长速率、生物量、虾青素含量和产量，选育出适合在较高和较低温度下大规模培养的雨生红球藻品系。但该育种方式下藻株发生变异的机率较小，育种周期长，选育的藻株普遍存在遗传性状不稳定的缺点。

2.2 诱变育种

诱变育种操作简单、成本低、效率高，使用较为广泛。通过物理或化学诱变选育雨生红球藻的报道较多。Tjahjono 等[18]用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理雨生红球藻，并利用琼脂板分离方法筛选出具有氟啶酮抗性的两个突变株、具有达草灭抗性的四个突变株以及具有尼古丁抗性的多个突变株。Tripathi等[19]分别采用不同照射时间的紫外线和不同浓度的甲基磺酸乙酯（EMS）处理雨生红球藻，发现藻细胞的生长速率和虾青素含量随着诱变剂量的增加而增加，但藻细胞存活率下降；将处理后存活的藻细胞进一步用除草剂进行筛选，并未得到单一的突变株。蒋霞敏等[20]主要研究了不同剂量紫外线照射后雨生红球藻细胞生长、色素含量等指标的变化。结果显示：经紫外线辐射后，藻细胞叶绿素和类胡萝卜素含量增加；经紫外辐射4～5 min 后，藻细胞虾青素含量显著提高。肖媛等[21]研究了波长范围为280～320 nm 的紫外线（UV-B）辐射对雨生红球藻细胞的一系列生理生化过程的影响。结果表明：UV-B辐射可降低雨生红球藻光合活性，抑制生物量的增加，改变类胡萝卜素和虾青素的含量并影响细胞内ROS 的含量，降低抗氧化酶活性。丁雅婷等[22]探索了等离子体、喹禾灵等不同诱变方式及不同筛选条件对雨生红球藻的影响，最终筛选出生物量和虾青素含量均有所提高的三株优良性状突变藻株。诱变育种对遗传物质DNA 的操作针对性不强，且在操作时对人体及环境有一定的危害性，但现代分子遗传学和基因工程等相关科学技术的迅猛发展为定向诱变奠定了基础。

2.3 基因工程育种

基因工程育种是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使目标基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。基因工程育种目标明确、针对性强，但安全性还有待进一步验证。郑凯静等[23]利用RT-PCR 技术从一株雨生红球藻总RNA 中扩增出β-胡萝卜素羟化酶基因的cDNA 序列，并经过多序列比对分析表明，雨生红球藻与莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii 的亲缘关系较近，与其他高等植物以及细菌的亲缘关系较远。王娜[24]等从雨生红球藻中克隆出IPP 异构酶基因（ipiHp1），并利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens 侵染法和基因枪转化法，将目的基因导入雨生红球藻中。结果发现大部分转化子的生物量与野生型相似，农杆菌侵染法转化的转化子A3 虾青素含量比野生型显著提高，而基因枪转化法转化的转化子虾青素含量与野生型并无显著性差异。龚文芳等[25]利用杜氏盐藻Dunaliella salina lycB 基因构建雨生红球藻RNAi载体，并将其导入雨生红球藻细胞，发现能干扰雨生红球藻番茄红素环化酶，进而影响其β-胡萝卜素合成代谢。侯善茹等[26]以植物表达载体构建了农杆菌介导的雨生红球藻转化方法，成功并稳定地表达了报告基因GFP 和YFP，拓宽了pBI121 载体的应用范围，为雨生红球藻的转化开辟了新的遗传转化途径。总体而言，目前雨生红球藻转化仍然主要依赖于基因枪方法，但可用的表达载体以及筛选标记少、外源基因不能表达等问题仍有待进一步解决。

2.4 细胞融合与杂交育种

细胞融合是将酶解去壁的2 种不同细胞的原生质体融合在一起，经生长分化，诱导形成新品种。细胞融合可以打破物种界限，实现远源基因重组，缩短育种周期，提高育种水平。Tjahjono 等[18]将雨生红球藻的一系列抗抑制物突变体进行原生质融合后得到杂交株，其虾青素的含量是野生型的3 倍。Abomohra 等[27]研究了雨生红球藻与一株金藻门的藻株Ochromonas danica 的细胞融合，并通过脂肪酸分析证明了融合子不同于两种亲本藻株。小球藻Chlorella vulgaris 和雨生红球藻同属绿藻门，亲缘关系较近，因此曾有研究者提出将雨生红球藻同小球藻进行原生质体的融合，希望能获得快速生长和抗逆性强的杂交品种[28]。但该研究虽然获得了杂交的株系，但并未开展异养株的筛选工作，仅对杂交克隆的脂肪酸组成等杂交表型进行了分析。为提高雨生红球藻糖异养生长能力，研究人员利用PEG 介导融合技术将雨生红球藻与小球藻原生质体进行融合。试验中观察到典型的融合现象，获得了雨生红球藻形态的融合子克隆，其生长速率比野生型雨生红球藻显著提高，但在后续传代过程中表型分化现象时有出现，说明异源基因组间的重组效率不高[29]。虽然关于雨生红球藻细胞融合的研究较少，但细胞融合可以突破有性杂交过程中的隔离机制，拓宽育种领域，为远源物种间遗传物质交换提供了有效途径，应用前景广阔。

3 总结与展望

雨生红球藻的育种研究进展较为缓慢，早期大多采用传统的选择育种和诱变育种方法，育种时间长，工作量大。随着细胞生物学和分子生物学的不断发展，细胞融合和基因工程等新的育种技术不断应用于雨生红球藻的育种工作中，为培育稳定遗传的良种藻株提供了快速高效的途径。将传统的育种技术与现代育种技术相结合，取长补短，是未来微藻良种培育的关键。将原生质体融合技术同基因组诱变技术相结合，建立更高效的藻种间基因组杂交筛选技术，为雨生红球藻藻种改良建立更稳定的改造体系与平台。