天麻酵素化过程中风味物质及抗氧化活性动态变化

赵敏，王瑜，李立郎，安正斌，解春芝，林灵，杨小生，杨娟*

1(贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳，550025) 2(药用植物功效与利用国家重点实验室(贵州医科大学)，贵州 贵阳，550014) 3(贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳，550014) 4(徐州工程学院 食品与生物工程学院，江苏 徐州，221018)

天麻是我国传统的名贵中药材，为兰科天麻属植物天麻(Gastrodiaelata)的干燥块茎[1]，主产于贵州、四川、云南等地。天麻中含有天麻素、巴利森苷、对羟基苯甲醇等活性成分[2]，具有增强记忆、改善老年痴呆、抗衰老、镇静催眠等功效[3]。天麻的食用方式主要是将鲜天麻炮制成天麻粉，但其不利于人体吸收且天麻本身具有不良的“马尿臭”气味[4]，难以被消费者接受。酵素是以动植物、食用菌等为原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品[5]。大量研究表明，酵素具有抗氧化、降脂、解酒、促进消化等[6]功效。因此，通过酵素化工艺处理是天麻深加工的一种途径。随着对天麻的食用安全性的深入研究，2020年贵州已将天麻作为新资源食品开展了试点工作。因此，从食品的角度开发天麻具有重要的应用前景。而目前，国内外对天麻的研究主要关注于药理作用，对于鲜天麻酵素化过程中风味物质和抗氧化活性的动态变化研究少有报道。

因此，本研究以鲜天麻为研究对象，通过氨基酸自动分析仪、固相微萃取-气相色谱-质谱(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)联用技术对天麻酵素化过程中游离氨基酸和挥发性物质变化进行研究，同时采用试剂盒对酵素化过程中的总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、DPPH自由基清除能力与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性进行定量分析，以期初步明晰天麻酵素化过程中的风味物质及抗氧化活性成分动态变化，为天麻的高值化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

德江天麻，贵州省德江县绿通天麻发展有限公司；发酵剂，贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室自制，优势菌株为酵母菌，乳酸菌，醋酸菌；纤维素酶，南宁庞博生物工程有限公司；磺基水杨酸，天津市科密欧化学试剂有限公司；SOD活性、DPPH自由基清除能力、T-AOC检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HP6890/5975C气质联用仪，美国Agilent公司；固相微萃取装置，美国Supelco公司；S433D型全自动氨基酸分析仪，德国Sykam公司；YH-A20002型电子天平，瑞安市英衡电器有限公司；22010型搅拌机，佛山艾诗凯奇电气有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 天麻的发酵工艺

新鲜天麻清洗干净后打浆，装入发酵坛内按照其质量比1∶1加入沸水(温度>90 ℃)搅拌熟化，再添加10%(质量分数)的白砂糖，搅拌使白砂糖完全溶化，待温度降至50～60 ℃时，添加0.02%(质量分数)的纤维素酶，待温度降至30～40 ℃时，最后添加0.03%(质量分数)的发酵剂，用保鲜膜密封发酵坛，在无氧条件下发酵10 d后，去掉保鲜膜换成纱布进行有氧发酵，发酵到第30天，用牛皮纸封口贮藏陈酿，陈酿至60 d结束发酵。

样品的取样时间分别为：0 d(加发酵剂前)；7 d(发酵液开始澄清)；10 d(无氧发酵结束)；20 d(形成菌膜)；30 d(菌膜稳定，完成发酵)；60 d(贮藏陈酿阶段)。每个阶段取样后，将样品置于-80 ℃的超低温冰箱内保存待测。

1.3.2 游离氨基酸含量的测定

采用氨基酸自动分析仪进行检测，准确称取1.022 g 磺基水杨酸至100 mL容量瓶中并定容，配制成1%的磺基水杨酸溶液；取不同样品1 mL分别加入9 mL磺基水杨酸溶液，振荡均匀，10 000 r/min离心15 min，上清液经0.22 μm水系滤膜过滤后上机检测。

1.3.3 挥发性成分的测定

萃取方法：取样品5 mL置于固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，在60 ℃的平板加热条件下顶空萃取60 min后，移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口(温度250 ℃)中，热解析进样。

气相色谱条件：色谱柱为Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm，0.25 μm)弹性石英毛细管柱，初始温度42 ℃ (保留2 min)，以3.5 ℃/min升温至189 ℃，再以8 ℃/min升温至310 ℃，运行时间：67.13 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压111 212.43 pa，载气流量1.0 mL/min，分流比10∶1，溶剂延迟时间1 min。

质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA； 倍增器电压1 671 V；接口温度280 ℃；质量范围29～500 amu。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist 17和Wiley 275标准质谱图，确定X种挥发性化学成分，用峰面积归一化法测定各化学成分的相对质量分数。

1.3.4 抗氧化活性的测定

T-AOC、DPPH自由基清除能力、SOD活性均采用试剂盒进行检测。

T-AOC按公式(1)计算，以Fe2+终浓度为横坐标，以不同浓度Fe2+对应的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，所得标准曲线为Y=5.104 8X+0.004 4，R2=0.999 8，线性较好，可用于后期实验。

(1)

式中：V1为反应总体积，1.02 mL；V2为反应中样品体积，0.03 mL；X为标准曲线中的函数变量。

DPPH自由基清除率按公式(2)计算：

(2)

式中：A0、A1、A2分别为空白管、对照管和测定管于515 nm处测定的吸光值。

SOD活性按公式(3)～公式(6)计算：

ΔA1=A1-A2

(3)

ΔA0=A10-A20

(4)

(5)

(6)

式中：A1、A2、A10、A20分别为测定管、对照管、空白管1和空白管2于560 nm处测定的吸光值；F为样品稀释倍数。

1.3.5 数据处理

使用Excel 2018对实验数据进行录用和计算，采用Data Analysis对气质联用的峰面积进行积分与提取，Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 天麻酵素化过程中风味物质分析

2.1.1 天麻酵素化过程中游离氨基酸含量与组成分析

由表1可知，天麻酵素化过程中氨基酸的总含量(total content of amino acids，TAA)呈先下降后上升的趋势，可能是发酵前期酵母菌利用葡萄糖和氨基酸进行无氧发酵转化为酒精以及氨基酸自身的氧化降解，导致氨基酸含量降低；发酵后期氨基酸含量上升，可能是微生物细胞中的氨基酸溶出造成[7]。必需氨基酸(essential amino acids，EAA)影响食物营养价值，联合国粮农组织和世界卫生组织提出氨基酸以EAA/TAA约40.00%为佳[8]，天麻汁的EAA/TAA为18.26%，经陈酿后天麻酵素中的EAA/TAA可达到50.76%，比天麻汁增加2.7倍，说明天麻汁酵素化处理后营养价值更高。

表1 天麻酵素化过程中氨基酸质量变化

滋味活度值(taste activity value，TAV)[9]表示氨基酸含量与其味觉阈值比值。TAV>1时，则该氨基酸对样品的滋味有贡献，TAV与氨基酸滋味的贡献呈正比，当TAV<1时，该氨基酸对样品的滋味没有贡献。由表2可知，天麻汁中丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、缬氨酸(Val)、精氨酸(Arg)的TAV均>1，说明这9种氨基酸对天麻汁的滋味贡献较大，其中谷氨酸(17.10)和精氨酸(4.88)的TAV最大，Glu可提供强烈的鲜味，Arg具有苦涩味[10]，天麻汁以鲜味和苦味为主，此时呈现一定的鲜甜味和苦涩味，滋味不佳。经陈酿后，苦味氨基酸中精氨酸的TAV下降，甜味氨基酸中Ala和His的TAV上升，甜味和鲜味是天麻酵素的主要呈味氨基酸，此时鲜甜味浓郁、苦味淡薄，滋味更佳。

表2 天麻酵素化过程中游离氨基酸的TAV变化

2.1.2 天麻酵素化过程中挥发性风味物质分析

由表3可知，天麻汁(发酵0 d)共检出26种挥发性风味物质，其中醇类5种，相对含量为8.30%；醛酮类和酯类均为4种，含量分别为6.40%、3.90%；烷烃类种类最多为8种，含量可达3.61%；萜烯类种类最少为1种，相对含量为2.81%；醚类2种，醚类含量最高为74.18%。醚类在天麻汁中的含量最大，是天麻汁的主要挥发性物质，醚类一般具有烟熏、刺鼻、异味等气味[11]，可能是造成天麻汁马尿臭气味、杂味的原因。

表3 天麻酵素化过程中挥发性成分的变化 单位：%(相对含量)

天麻酵素化过程中(发酵7～30 d)共检测出46种挥发性风味物质，其中醇类5种、醛酮类和酚类均为3种、酯类最多为27种、烷烃类4种、萜烯类2种、酸类1种。其中醇类在酵素化过程中呈现先增加后减少的趋势，在发酵20 d相对含量最高为89.61%。 醇类主要来源于酵母菌等微生物酒精发酵，对食品的风味有较大的影响，是助香剂也是形成其他风味物质的前体，少量高级醇可以使酒体醇甜，香气丰满[12]。如乙醇可以赋予食品苹果甜香的风味特征[13]。苯乙醇具有玫瑰花香和茉莉花香等多种风味，给人以柔和愉悦的感觉[14]。酯类物质呈现先上升后下降的趋势，发酵7 d时相对含量最高为18.84%，其中乙酸乙酯、山梨酸乙酯、9-十八酸乙酯、3-苯基丙酸乙酯、苯甲酸乙酯逐渐增加，乙酸异戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯先增加后下降。酯类是发酵过程中酸跟醇发生反应产生的，赋予天麻酵素独特的香味[15]。如9-十八酸乙酯有淡淡的花味，辛酸乙酯具有类似白兰地的香气[16]，苯甲酸乙酯具有浓烈的花香，并带有水果的清香气味，癸酸乙酯具有似葡萄的水果香气[17]。因此，这些酯类作为天麻酵素中酯类物质的骨架成分，对天麻酵素的品质和香气起着决定性作用。醛酮类是由酵母菌代谢产生，风味阈值较低，但是醛酮类物质的香气能够作用于感官使得天麻酵素的香气提升。萜烯类主要来源于植物原料，对天麻酵素的风味具有改善作用。醚类、烷烃类在发酵过程中含量虽然较低，但是丰富了天麻酵素的风味层面。与天麻汁相比，经过微生物发酵后的天麻酵素花果香浓郁、口感柔和且未出现马尿臭等不良风味。说明酵素化技术可以显著改善天麻本身具有的不良风味。

天麻酵素经陈酿后(发酵60 d)共检测出49种挥发性风味物质，其中醇类7种，相对含量最高可达66.86%；醛酮类、萜烯类、酸类均为2种，相对含量分别为0.89%、 0.27%、0.20%；酚类4种，相对含量为2.09%； 酯类种类最多为20种，相对含量可达28.10%， 其中乙酸乙酯的相对含量最高为11.80%；烷烃类8种，相对含量为0.57%；醚类1种，相对含量为0.44%。相比于发酵后的天麻酵素，经陈酿后醇类、醛酮类、萜烯类、醚类含量降低，其中醇类可以生成醛酮类，而醛酮类物质与有机酸发生酯化反应，生成大量酯类[18]，酯类的变化与尹小庆等[19]在研究小米辣鲊辣椒发酵过程中风味物质的变化一致。因此，经陈酿后，酒精度适当降低，芳香味更加突出。

2.2 天麻酵素化过程中抗氧化活性变化研究

2.2.1 天麻酵素化过程中T-AOC分析

T-AOC是评价样品中的各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平的重要指标[20]。如图1所示，T-AOC的含量在发酵前期呈现下降的趋势，在发酵20 d达到最低为2.52 μmol/mL；发酵后期不断上升，在陈酿阶段达到最高为5.87 μmol/mL，相比于天麻汁上升了0.7倍。这可能是发酵前期样品中含有较多的游离羧基与Fe2+形成螯合物，而减少自由基的形成；在发酵后期微生物酶解一些中性和酸性氨基酸，自由基含量增加[21]。

图1 天麻酵素化过程中T-AOC的变化

2.2.2 天麻酵素化过程中DPPH自由基清除能力分析

DPPH自由基清除率广泛运用于测定自由基清除能力。由图2可知，DPPH自由基清除率在整个酵素化过程中不断上升，天麻汁的DPPH自由基清除率只有62.36%，陈酿阶段样品中DPPH自由基清除率最高可达99.37%，这可能是酵素化过程中，蛋白质在水解酶的作用下水解导致一些具有抗氧化性的氨基酸残基暴露，DPPH自由基清除率升高[22]。

图2 天麻酵素化过程中DPPH的变化

2.2.3 天麻酵素化过程中SOD活性分析

图3 天麻酵素化过程SOD活性的变化

3 结论与展望

在天麻酵素化过程中，总氨基酸的含量呈现先下降后上升的趋势，陈酿结束后为1 971.79 mg/100g，天麻汁的EAA/TAA为18.26%，经发酵陈酿后天麻酵素中的EAA/TAA达到50.76%，相比于天麻汁增加了2.7倍，在呈味氨基酸中，天麻汁以鲜味和苦味为主，经陈酿后，天麻酵素以鲜味和甜味为主。天麻汁主要香气物质为醚类，发酵期间，醇类在发酵20 d 达到最大值为89.61%，醚类物质被微生物降解，马尿臭味消失，其主要香气物质为醇类和酯类，陈酿阶段，酯类物质的相对含量达到最高，说明陈酿对香味的形成具有至关重要的作用。T-AOC、DPPH自由基清除能力与SOD活性在发酵过程中整体均呈现逐渐上升的趋势，在陈酿结束后达到最大值，分别为5.87 μmol/mL、 99.37%与25.72 U/mL，其中SOD活性相比于天麻汁增加了25倍。

天麻是传统的药食同源类药物。目前，国内外对天麻的研究主要关注于天麻的药理作用，而对天麻酵素的开发与研究的报道较少。因此，本论文初步探讨了天麻在不同酵素化阶段风味物质和抗氧化活性的动态变化，后期将对天麻酵素中的功能性成分进行研究，并结合改善小鼠睡眠实验，进一步深入研究天麻发酵过程中的目标代谢产物，明晰天麻酵素的药理活性以及作用机制，为促进天麻的发展提供理论支撑。