外泌体在年龄相关性黄斑变性发病机制与诊疗方面的研究进展

刘金霞，秦宇

(中国医科大学眼科医院 辽宁省晶状体学重点实验室 中国医科大学附属第四医院眼科，沈阳 110005)

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degene-ration，AMD)是造成老年人不可逆性视力障碍的主要原因[1]。其可分为萎缩型(干性)和渗出型(湿性)两种。其中，萎缩型约占80%，以黄斑区地图状萎缩和玻璃膜疣为特点，患者常出现视物模糊和变形症状；渗出型以脉络膜新生血管(choroidal neovascularization CNV)为特征，其视功能严重损伤的病理学基础即黄斑区CNV形成[2]。目前，AMD的发病机制尚未完全清楚，炎症与免疫功能紊乱、血管生成与抑制失调、光损伤及氧化应激反应等均有报道[3]。对于AMD的治疗，干性AMD主要着眼于补体抑制、神经保护、细胞疗法和抗炎药物治疗，湿性AMD则更注重新的、潜在更持久的抗血管内皮生长因子制剂及缓释装置和基因治疗等[4-5]。

外泌体最初于1987年在绵羊红细胞中发现，直径为30～100 nm，多种体液中均含有外泌体，如血浆、血清、尿液、唾液、精液、母乳、房水和脑脊液等。由于外泌体的来源细胞多样，其功能也各不相同[6-7]。近年来，外泌体在眼科领域的研究逐渐增加。研究显示,视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell，RPE)、睫状体上皮细胞、小梁细胞等均可分泌外泌体[8-9]。其参与了AMD发生发展过程中的新生血管生成、玻璃膜疣形成、免疫调节等环节[2]。现就外泌体在AMD发病、诊断和治疗等方面的研究进展予以综述，以为AMD的发病机制和诊疗策略研究提供新思路。

1 外泌体

1.1外泌体的产生 外泌体的形成过程包括浆膜的双重内陷以及含有腔内囊泡的多囊泡体形成。浆膜的第一次内陷形成一个杯状结构(包括细胞表面蛋白和与细胞外环境相关的可溶性蛋白)导致早期核内体形成。随后，早期核内体逐渐成熟变为晚期核内体，晚期核内体膜内陷产生多囊泡体(即浆膜的双重内陷)。多囊泡体既可以与溶酶体或自噬体融合降解，也可以与质膜融合，将所含的腔内囊泡释放成为外泌体[10]。

1.2外泌体的分离提取 目前，有关外泌体的提取方法主要有多步差速离心法、聚乙二醇沉淀法、蔗糖密度梯度离心法、免疫亲和色谱法、尺寸排除色谱法等。每一种提取方法在产量、纯度、成本及生物活性等方面不尽相同[11]。常用的外泌体鉴定方法包括电镜检测、纳米粒子追踪分析、外泌体表面蛋白检测。其中，电镜检测和纳米粒子追踪分析可确定外泌体的形态、数量及直径大小，蛋白质免疫印迹法及流式细胞术可检测外泌体表面标志性蛋白CD9、CD63、CD81、血清膜联蛋白A5、肿瘤易感基因101、浮舰蛋白-1等，因为这些标志物不仅可用于识别外泌体，而且与直接从细胞表面释放的其他微囊泡相比，还显示了外泌体在细胞内的独特起源[12]。

1.3外泌体的生物学功能

1.3.1细胞间信号转导 外泌体最主要的功能为介导细胞间信号转导。细胞外囊泡分为外泌体和细胞外颗粒两种，从母细胞中释放后，这两类囊泡在细胞外液中游走不同的时间和距离，随后与靶细胞的内吞膜或质膜融合，并将腔内成分释放到胞质中，导致靶细胞生理性能发生变化。融合后，外泌体或外泌体成分可以在新的囊泡中重新组装，再循环至其他细胞中，激活一系列效应网络，发挥细胞间信号转导作用[13]。研究发现，在乳腺癌的发生发展过程中，由耐药细胞分泌的外泌体可大量携带环状RNA-UBE2D2，并将其转移至亲本细胞中；由外泌体介导转移的环状RNA-UBE2D2能够与其靶基因微RNA(microRNA，miRNA/miR)-200a-3p相互作用，增强乳腺癌细胞的他莫昔芬耐药性，为提高他莫昔芬对乳腺癌患者的疗效提供新见解[14]。

1.3.2肿瘤微环境形成 自Stephen Paget于1889年提出“seed-and-soil”假说以来，器官定向性转移一直是肿瘤最大的谜团之一[15]。Hoshino等[16]证明，来自小鼠和人类的肺、肝和脑嗜肿瘤细胞的外泌体优先与预期目的地的驻留细胞融合，即肺成纤维细胞和上皮细胞、肝库普弗细胞和脑内皮细胞，从而形成肿瘤的转移前微环境，促进肿瘤的器官定向性转移。Liu等[17]研究表明，胃癌细胞系(MKN-45、MKN-28等)来源的外泌体由肺巨噬细胞和自然杀伤细胞摄取后，改变肺CD8+T细胞的基因表达和细胞因子分泌，形成一种免疫抑制的肿瘤微环境，从而促进胃肿瘤的肺转移。

1.3.3免疫学作用 大部分免疫细胞能分泌外泌体，如树突状细胞、T细胞、B细胞等。而免疫细胞源性外泌体在抗原呈递、免疫应答、免疫调节以及免疫赦免等方面均发挥至关重要的作用，可以刺激或减弱免疫反应，这些作用的发挥均取决于细胞环境、分子组成和产生免疫细胞外泌体的微环境[18]。有研究显示，内质网应激能够促进乳腺癌细胞分泌miR-27a-3p高表达的外泌体，这种外泌体能够通过支架蛋白MAGI-2(membrane-associated guanylate kinase inverted-2)/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇-3-激酶通路上调程序性死亡配体1的表达，从而促进乳腺癌的免疫逃逸[19]。另有研究证实了外泌体在癌症免疫治疗中的强大功能，其可作为肿瘤免疫治疗的介质、药物载体和预后生物标志物[20]。

2 外泌体与AMD

近年来，有关外泌体在眼科疾病中应用的研究逐渐增多，包括角膜疾病、青光眼、糖尿病性视网膜病变以及AMD等[11]。2012年，廖志雄等[21]首先在兔房水中分离和提取出外泌体，并发现其明显抑制T细胞的增殖，故认为外泌体很有可能参与了眼球免疫耐受的维持。Zhang等[22]研究发现，氧化应激损伤的RPE可分泌富含白细胞介素-1β、白细胞介素-18和胱天蛋白酶1的外泌体，这些外泌体又能进一步加剧RPE的氧化应激反应。而RPE损伤与AMD的形成密切相关，因此RPE来源的外泌体可能参与了AMD的发生发展[22]。

2.1外泌体与新生血管形成 CNV是AMD患者致盲的主要原因，其以新生血管生成和视网膜下血液聚集为特征，从而对RPE造成机械性压迫[23]。研究发现，与正常RPE比较，氧化应激损伤的RPE分泌到细胞外基质的外泌体水平升高且携带血管内皮生长因子受体1和2，从而影响邻近血管内皮细胞，促进内皮细胞新生血管形成；当细胞内氧化刺激水平升高时，血管内皮生长因子受体1和2的信使RNA水平明显升高，促血管生成效应也明显增强[24-25]。

Hajrasouliha等[26]发现，视网膜星形胶质细胞(retinal astrocytes，RAC)分泌的外泌体具有抗血管生成作用。Zhu等[27]研究表明，从正常和高度自噬的RAC中提取的外泌体对人脐静脉内皮细胞转移和血管生成的作用截然不同。他们发现，从正常RAC中提取的外泌体能明显抑制人脐静脉内皮细胞的血管生成；而在氧化应激条件下，由于RAC自噬水平升高，从中提取的外泌体会促进人脐静脉内皮细胞的转移和血管生成。因此，研究RAC源性外泌体的成分及其功能，可能能为改善AMD中CNV的抗血管生成治疗提供新靶点和思路。

2.2外泌体与玻璃膜疣形成 布鲁赫膜是一种五氨基膜复合体，邻近RPE的基底侧，包括其基底外侧细胞膜。它将RPE单层与体循环有孔毛细血管床(即脉络膜毛细血管)分离，因此在介导流向RPE和光感受器的氧、电解质、营养物质和细胞因子，以及代谢废物和信号分子的外排方面起至关重要的作用。早期AMD的发病机制以布鲁赫膜的增厚为特征，这是由于脂质和蛋白的积累导致视网膜下沉积物的形成，称为玻璃膜疣[28]。Klingeborn等[29]分析了在稳态条件下从RPE基底侧和顶端释放的外泌体蛋白质组，结果显示，RPE分泌的外泌体中含有631种蛋白质，其中有299种为顶端特异性释放，94种为基底侧特异性释放，由此推断RPE的极性能够影响外泌体的定向释放。这也将为外泌体在视网膜疾病的发生、靶向治疗和诊断标志物方面的应用奠定基础。

Wang等[30-31]研究发现，线粒体DNA受损的RPE的胞吐活性增强，使携带细胞内蛋白的外泌体释放增加。同时，外泌体标志物CD63、CD81和溶酶体关联膜蛋白2在AMD患者的玻璃膜疣中出现，且CD63与玻璃膜疣表面的β淀粉样蛋白、αB-晶体蛋白、C5b-9和补体因子H(complement factor H，CFH)共表达。因此推测在AMD患者的RPE中，由于细胞的胞吐活性增强，细胞内蛋白通过外泌体释放增加，从而促进玻璃膜疣的形成。另有研究表明，载脂蛋白E与外泌体和腔内囊泡的膜结合是色素细胞中淀粉样纤维形成的重要调节因素[32-33]。外泌体与载脂蛋白E的这种关联也促使研究者重新考虑载脂蛋白E和外泌体在AMD中的作用，因为载脂蛋白E是玻璃膜疣的重要组成部分。

2.3外泌体与免疫反应 眼睛作为一个独特的视觉感觉器官，一直为一个免疫赦免位点，防止免疫原性炎症的发生[34]。然而有研究表明，在AMD的发病过程中，除RPE退化变性外，免疫反应也参与其中[35]。补体系统是天然免疫的主要组成部分，也是AMD发病机制的关键组成部分[36]。CFH基因编码因子H(factor H，FH)及其较小的剪接变异体因子H相关蛋白(factor H related protein，FHR)-1，FH是主要的血浆补体调节因子，而FHR-1在布鲁赫膜和脉络膜毛细血管中占主导地位[37]。Sivapathasuntharam等[38]研究发现，CFH基因敲除(CFH-/-)小鼠出现明显的视网膜病变和脉络膜部分塌陷，故认为CFH不仅是影响视网膜发育的重要因素，而且CFH-/-小鼠视网膜发育异常也可能作为AMD发生的病变基础。研究表明，FHR-4在脉络膜毛细血管、布鲁赫膜和玻璃膜疣中聚集，随着FHR-4的不断累积，引起补体过度周转，最终导致循环免疫细胞的激活和募集，而该现象也是早期AMD的一个关键特征。

Wang等[30]发现，外泌体标志蛋白CD63与CFH在AMD患者的玻璃膜疣中共表达，且CFH以一种剂量依赖性方式与RPE分泌的外泌体结合，故他们认为由C3包裹的外泌体很有可能是CFH的作用靶点。关于AMD中外泌体与免疫反应之间的关系目前尚不清楚，未来需进一步研究。

2.4外泌体作为AMD诊断的标志物 外泌体作为理想的生物标志物具有以下特征：①外泌体的脂质双分子层可以为其内容物提供保护；②外泌体的内容物由组织、细胞和疾病特异性蛋白质或核酸组成；③外泌体性能稳定，从体液中分离和富集的方法多样[11]。从RPE的基底侧释放的外泌体可通过脉络膜进入全身循环，因此可能成为血液中视网膜疾病生物标志物的潜在来源[39]。

为了寻找与AMD发生发展相关的分泌性生物标志物，Kang等[40]对来自RPE条件性培养基、条件性培养基以及AMD患者房水外泌体中的蛋白质进行了比较，结果发现多种蛋白质在视网膜色素上皮细胞系ARPE-19外泌体和AMD患者房水外泌体中均表达，排除其他可能分泌外泌体的细胞(Müller细胞和视网膜神经节细胞)外，认为RPE可能是AMD患者房水中外泌体的主要来源，因此房水中的外泌体可作为AMD的生物标志物。

在AMD的发病机制中，许多miRNAs与细胞增殖、迁移、凋亡和新生血管形成相关。Elbay等[41]研究发现，与对照组相比，湿性AMD组患者血清中的miR-486-5p和miR-626明显高表达，而miR-885-5p 表达明显下调。因此推断，这些miRNAs在湿性AMD中的特异性表达可能成为诊断和评价AMD的一种新生物标志物。

2.5外泌体与AMD的治疗 对于湿性AMD，目前临床常用的治疗方法为玻璃体腔内注射抗血管生成药物，但这种给药方式会产生一些并发症，如结膜下出血、感染性眼内炎、玻璃体积血等，因此提高注射安全性一直是玻璃体腔内注射抗血管生成药物的研究重点[42]。Hajrasouliha等[26]通过对CNV小鼠结膜下注射RAC源性外泌体发现，结膜下注射外泌体可以使药物从结膜快速运送至脉络膜和视网膜。该结果提示，结膜下外泌体注射或许是一个更为安全有效的给药方式。

α-晶体蛋白是小热激蛋白家族的主要成员，在RPE的胞质和线粒体中表达，在氧诱导的视网膜病变和发育过程中受到调节。此外，α-晶体蛋白可保护RPE免受氧化应激和内质网应激诱导的损伤和自噬。同时，α-晶体蛋白也是血管生成因子和血管内皮生长因子的调节因子，通过外泌体途径分泌。而α-晶体蛋白衍生的伴侣蛋白可防止氧化剂诱导的细胞死亡，因此对AMD具有治疗潜力[43-44]。

CFH是由RPE产生的一种补体因子，有助于C3转化酶的衰变，防止C3b沉积的扩增。研究表明，CFH的变异体对AMD新生血管的治疗有较好的反应[45]。Cashman等[46]研究发现，C3诱导的小鼠视网膜病变能够被CFH的表达所抑制。因此，CFH的表达作为一种潜在的AMD基因治疗手段值得进一步研究。

3 小 结

AMD作为一种不可逆性的老年性致盲眼病，为患者及其家属带来极大负担，手术治疗以及抗血管内皮生长因子治疗等方法虽然有一定的疗效，但仍存在并发症、疗效不佳等问题。外泌体作为一种天然载体，可将一种细胞的蛋白质、核酸等转运到另一种细胞中，因此可作为靶向治疗的理想载体，但这种效应目前主要应用于肿瘤领域，在眼科疾病中应用较少。眼科来源的外泌体通过携带脂质、核酸、蛋白质等多种物质发挥细胞间信号转导、免疫调节作用，或作为药物载体，为AMD的诊断和治疗提供新思路，但其具体作用机制还需进一步研究。