手持拉曼光谱快速筛查模拟保健品中10种那非类物质的研究

摘要：基于金和银纳米溶胶的表面增强拉曼光谱（SERS）技术，借助手持式拉曼光谱仪建立一种保健品中非法添加10种那非类物质的筛选方法。制备两种常见的金和银纳米溶胶用于增强拉曼信号，然后对玉米淀粉和白酒模拟样品进行简单的处理，探究标准溶液和模拟样品的检测限并对该方法的假阴性率和假阳性率、特异性等进行了评价，均符合食品快速检测方法评价技术规范。该方法可在现场对保健品中那非类物质进行快速、准确、简单的筛选，满足现场快速检测的需求。

关键词：保健品;那非类物质;表面增强拉曼光谱;快速筛查

Abstract：Based on the surface enhanced Raman spectroscopy （SERS） technology with gold and silver nano-colloid， a method for screening 10 kinds of PDE-5 illegally added in health care products was established by using handheld Raman unit. Two familiar gold and silver nanoparticles were prepared to enhance Raman signal. Then the cornstarch and liquor spiked PDE-5 were pretreated simply， and then obtained the detection limits of standard solution and simulated samples. The false negative rate， false positive rate and specificity of the method were evaluated， which all accorded with the technical specification for rapid food inspection. This method can realize the rapid， accurate and simple screening of PDE-5 in health care products on site， so meet the needs of rapid detection on site.

Key words：Health products; PDE-5; Surface-enhanced Raman spectroscopy; Rapid screening

1引言

那非类物质（Phospjodiesterase type 5， PDE-5）是一类5型磷酸二酯酶的抑制剂，可作为性增强剂或男性的壮阳产品，改善勃起功能障碍的症状[1]，是中成药保健品中最常见的掺假物质。一些不法分子为了追求高额利润，往中成药和酒类保健品中非法添加那非类物质，给消费者带来严重的健康风险，如头痛、消化不良、背痛、鼻炎、流感综合征等。2012年3月20日，国家食品药品监督管理局为了严厉打击保健食品生产中非法添加物质的违法违规行为发布《保健食品中可能非法添加的物质名单（第一批）》，声称缓解体力疲劳（抗疲劳）功能产品和声称增强免疫力（调节免疫）功能产品可能违禁添加那非类物质。

目前，实验室常见的检测方法有气质联用法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）和液质联用法等[2-4]。黄芳等[4]采用液相色谱-质谱法对中成药中非法添加的17種补肾壮阳化学物质进行了定性和定量检测，检测限为0.05～1.25mg/kg。虽然这些检测方法具有较高的灵敏度，但由于前处理繁琐、检测耗时、仪器不便、试剂昂贵等缺点，限制了这些方法的发展，无法满足食品监管部门现场执法的迫切需求。国家公安机关还专门成立食药环侦部门保障食品安全，对保健品中非法添加化学成分专项整顿和打击，亟需要一款携带方便、检测速度快、准确性高的仪器，提高现场的应急响应能力，对大量样品先进行初步筛查，若为阳性再进行确证性检验。

与上述方法相比，表面增强拉曼光谱技术（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）作为一种超灵敏、无标记的化学指纹分析方法，近几十年来受到了人们的关注[5]。SERS技术适用于吸附于金属纳米粒子表面的待测物质的快速鉴别和筛选，提高拉曼检测灵敏度的同时能够猝灭荧光，很好地解决中成药等基质的强荧光干扰问题。此外SERS方法具有预处理简单、设备小巧、检测速度快等优点。近几年已有一些学者开展对那非类物质进行SERS检测的研究，例如刘元瑞等[6]应用薄层色谱表面增强拉曼光谱（TLC-SERS）检测中成药和保健品中的西地那非。郑娟梅等[7]利用金核银壳纳米颗粒的SERS技术分析保健酒中的西地那非，检出限为0.5 mg/kg。王红梅等[8]发现11种那非类物质可根据其结构分为5组，利用SERS技术对其进行快速检测。吴国平等[9]采用自制金纳米溶胶作为SERS增强试剂，测试21种查缴的保健品真实样品，准确度达到100%。至今还未有报道运用手持拉曼光谱结合金属溶胶同时筛查模拟保健品中10种西地那非的研究，故本文用玉米淀粉和白酒分别模拟固体和液体保健品，建立10种那非类物质检测的方法，并对此方法进行评价，为现场快速检测保健品中非法添加该物质提供新方法。

2材料与方法

2.1仪器与试剂

手持拉曼光谱仪（型号FirstDefender RM，Thermo Fisher Scientific公司）;离心机（型号CF16RXII，Hitachi公司）;涡旋振荡器（型号SAS，Stuart公司）;超纯水仪（型号A10，Milli-Q公司）;气体挥发装置（型号TS-18822，Thermo Fisher Scientific公司）;超声仪（型号S300H，Elmasonic公司）

氯金酸、柠檬酸三钠（99.99%，J&K Scientific公司）;硝酸银（ACS，Acros Organics）;二氯甲烷（AR，上海申博化工有限公司）;盐酸（GR，国药集团化学试剂公司）;石油醚、氢氧化钠、氢氧化钾、抗坏血酸、浓硝酸、乙醇、甲醇（AR，国药集团化学试剂公司）

2.2标准品标准品储备液配置

豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、他达拉非、氨基他达拉非、硫代艾地那非、伐地那非、伪伐地那非、红地那非、那红地那非标准品由中国食品药品检定研究院提供。纯度均≥98%。称取上述标准品0.01g（精确至0.00001g）于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，得到浓度为1000mg/L的储备液，-20℃避光贮存，有效期3个月。临用时配置到适当浓度。稀释配置各那非类物质的标准溶液，浓度分别为10、1、0.5、0.1、0.05mg/L。

2.3试验方法

2.3.1SERS增强基底金和银溶胶的制备

金溶胶及浓缩金溶胶的制备[10]：参考Frens经典方法，往煮沸的100mL0.01%的氯金酸溶液中逐滴加入1mL1%的柠檬酸三钠水溶液，颜色呈酒红色后即制得金纳米溶胶。准确量取1.5mL金溶胶于1.5mL离心管中，以10000rpm/min转速离心10min，去除上层透明水层，涡旋混匀即得浓缩金溶胶。

银溶胶的制备[11]：参考Lee和Meisel的经典方法，称取18mg硝酸银溶于100mL超纯水中，煮沸后逐滴加入2mL1%的柠檬酸三钠水溶液，再加热1h后即制得银纳米溶胶。

2.3.2样品前处理和SERS检测方法

2.3.2.1玉米淀粉模拟固体保健品前处理

准确称取1.0g样品于5mL试管中，加入5mL石油醚，振荡20s后离心，取上清液于另一个5mL试管中，再加入1.0mL0.1mol/L稀盐酸，振荡后待SERS检测。

2.3.2.2白酒模拟液体保健品前处理

准确量取0.5mL样品于10mL试管中，依次加入2mL0.1mol/L氢氧化钾溶液和3mL二氯甲烷，振荡20s，静置分层，取1mL下层溶液于玻璃瓶中，将提取液在50℃的水浴下氮吹至全干，然后用400μL0.1mol/L稀盐酸残留物，振荡后待SERS检测。

2.3.2.3SERS检测方法

他达拉非和氨基他达拉非：取200μL样品于拉曼测试瓶中，加入50μL浓缩金溶胶，混匀后测试。其它8种那非类物质：取200µL样品于拉曼样品池中，加入100µL银溶胶，混匀后测试。

3结果与分析

3.110种那非类物质标准溶液的SERS谱图

那非类物质的分子结构非常相似（图1），使用高分辨率的激光拉曼可以对其固体粉末进行常规拉曼表征。SERS檢测时溶液分子与纳米颗粒之间的吸附强弱使得不同官能团的振动谱峰增强或减弱，并伴有峰位置不同程度的偏移[12]。以西地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非为例，结构中哌嗪环4位上取代基甲基和乙基的区别并不能影响SERS的特征峰位置，这可能是因为甲基和乙基并不是吸附在纳米颗粒表面的官能团。如图1A所示，三种西地那非类在650、819、928、1234、1401和1581cm-1附近均有相同的特征峰。其中，1234cm-1谱峰对应于芳香化合物中=C-H面内弯曲振动与SO2的对称和不对称伸缩，1581cm-1处的谱峰由苯环、氮杂环的C=C与C=N伸缩振动引起[13]。相似地，伐地那非和伪伐地那非谱峰位置均在650、1235、1591cm-1（图1B）;他达拉非和氨基他达拉非用到的增强试剂是浓缩金溶胶，与其它那非类使用银溶胶不同，谱峰位置相比其他差异较大，特征峰均在576、796、814、915、1234cm-1（图1C）;红地那非和那红地那非的谱峰位置均在644、822、924、1241、1566cm-1（图1D）。硫代艾地那非与其它那非类的结构差异较大，主要特征峰在1108、1190、1270、1395cm-1（图1E）。

由上可知不同类型的那非类物质（西地那非类、红地那非类、伐地那非类、他达拉非类和硫代艾地那非）虽部分特征峰重叠，但出现峰偏移，且某一两处峰存在差异，故即使手持式拉曼光谱仪的分辨率不及台式显微拉曼，也可以将它们的类别区分开。比如对比图1A和1D，西地那非类和红地那非类的特征峰极度相似，但是红地那非类在1241和1225cm-1处有两个峰，西地那非类在1234cm-1有一个峰;对比图1A和1B，伐地那非类在1300～1500cm-1的弱峰较西地那非类多。此外经实验发现，他达拉非类用银溶胶测试无信号，而用浓缩金溶胶效果较好，故他达拉非类的信号明显与其它那非类不同。因此我们可以通过SERS方法，借助手持式拉曼光谱仪区分保健品中添加的是哪一类那非类物质。

3.2 10种那非类物质标准溶液及加标模拟样品的最低检测浓度

由高浓度到低浓度测试10种那非类物质标准溶液（浓度分别为10、1、0.5、0.1、0.05、0 mg/L），SERS信号随着标准品溶液浓度的减小逐渐减弱，直至无法检出。各那非类物质标准溶液最低检测浓度详见表1（第一列）。

模拟样品选用固体和液体两种基质进行制备，固体基质为玉米淀粉，液体基质为白酒（基质经质谱验证均不含以上10种那非类物质）。取空白基质若干份，分别添加浓度为200、100、50、10、5、0μg/mL 那非类物质准品至空白样本中，按照分析步骤进行测定，观察检测结果，SERS信号随着加标浓度的减小逐渐减弱，直至无法检出。经实验确定的两种基质的最低检测浓度结果详见表1（第三、四列）。玉米淀粉和白酒中10种那非类物质检测限浓度的SERS谱图分别如图2A、2B所示。

表1和图2均说明，不同那非类物质标准溶液的SERS测试增强效果不同，这与分子与纳米粒子表面的有效吸附相关[14]。即使同一类那非类物质，功能基团的略微差异也会影响峰的强弱，比如豪莫西地那非和羟基豪莫西地那非标准溶液的结构略微差异致使最低检测浓度不同。至于模拟样品，液体基质对红地那非类影响较大，相反固体基质对他达拉非类影响较大。但是整体来看基质的影响使得SERS检测限浓度相比标准品溶液提高一到两个数量级，这是因为基质干扰了那非类物质在纳米粒子表面的吸附，形成一种竞争吸附的模式，为此影响了分子间的应力或氢键作用力、分子吸附位点等。比如图2中两种基质对伐地那非的干扰小于伪伐地那非，故在相同加标浓度下，伪伐地那非的SERS信号远弱于伐地那非。

3.3快速检测方法评价

依据《食品快速检测方法评价技术规范》（食药监办科[2017]43号）的要求，对建立的10种那非类物质SERS快检方法进行方法学考察，在检出限水平附近设置固体/液体阴性对照样品、0.5倍检测限浓度水平样品、检测限浓度水平样品、2倍检测限浓度水平样品。固体和液体基质分开进行评价，评价结果详见表2。

3.3.1检测限

由3.2可知10种那非类物质在加标固体和液体模拟样品中的检测限，详见表1（第三、四列）。

3.3.2假阴性率和假阳性率

制备固体基质（玉米淀粉）、液体基质（白酒）在检出限水平的加标样品，每种那非类物质分加标制备6份，故固体基质阳性样品共计60份，液体基质阳性样品共计60份。同时分别制备固体和液体空白样品各5份，阴性样品共计10份。

固体基质阳性样品有1份样品未检出，假阴性率为1.67%;固体阴性样品均未检出，假阳性率为0%。液体基质阳性样品有2份样品未检出，假阴性率为3.33%;液体阴性样品检测均未检出，假阳性率为0%。

3.3.3特异性

在检出限水平阴性样品均未出现阳性结果，故那非类物质在玉米淀粉和白酒模拟样品中的特异性均为100%，如表2所示，符合食品快速检测方法评价技术规范要求。

3.3.4与现有方法一致性分析

将本研究方法与市场监管局发布的《食品中那非类物质的测定（BJS 201805）》食品补充检验方法（超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法）[15]所得到的阳性结果进行卡方检验，具体结果可见表2种显著性差异（x2）所示，这两种方法在5%置信区间内没有显著性差异（x2=<3.84），符合食品快速检测方法评价技术规范的要求。

4结论

本文借助手持式拉曼光谱仪对10种那非类物质同时进行SERS检测，经过筛选他达拉非类使用浓缩金溶胶作为增强试剂，其它那非类使用银溶胶。随之进一步探究不同那非类物质标准溶液的最低检测浓度为0.1～1 mg/L，以及加标玉米淀粉和白酒模拟样品的检测限为10～100mg/kg。在此基础上，对该方法的假阴性率和假阳性率、特异性等进行了评价，均符合食品快速检测方法评价技术规范。该方法具备现场可移动、快速、准确、简单等优点，相信未来能成为保健品中那非类物质快速检测的有效手段之一。

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作者简介

余婉松：1990.02，女，汉族，湖北省丹江口市人，上海海洋大学，硕士学历，食品科学与工程专业，毕业至今一直从事手持光谱仪器在食品安全检测中方法开发及应用技术支持等工作。

赛默飞世尔科技（中国）有限公司 上海 201206