Th17/Treg失衡在不明原因复发性自然流产中的作用

葛育文，张宁

(1.山东中医药大学中医学院，济南 250014； 2.山东中医药大学第一临床学院，济南 250014)

复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指孕妇在孕20周以前连续发生2次或2次以上的自然流产，其病因包括遗传、解剖、感染、内分泌、凝血等多种因素[1]。其中，约50%的RSA患者无明确的病因，这种无明确病因的RSA称为不明原因复发性自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[2]。URSA严重影响女性的生殖健康，且发病率逐年上升，因此急需寻找其具体发病机制及有效的治疗方法。近年有学者提出，母胎免疫异常可能是URSA的病因之一[3]。CD4+T细胞亚群是人体免疫环境的重要参与者，同时参与了母胎免疫耐受的建立和维持，而辅助性T细胞(helper T cell，Th)17和调节性T细胞(regulatory T cells，Treg细胞)均属于CD4+T细胞亚群，其中Th17细胞发挥促炎作用，Treg细胞发挥抑炎作用。研究认为，成功妊娠主要与Th1/Th2平衡相关[4]，但Th17/Treg平衡在维持正常妊娠中同样发挥重要作用，Th17/Treg失衡可能导致反复移植失败、URSA、子痫等多种妊娠疾病[5]。现就Th17/Treg失衡在URSA中的作用予以综述。

1 Th17细胞、Treg细胞的功能及分化

Th17细胞和Treg细胞分化自共同的前体细胞，即CD4+T细胞[6]。Th17细胞与Treg细胞的免疫调节功能截然相反，Th17细胞具有促炎作用，Treg细胞具有抑炎作用，两者保持微妙平衡才能维持人体免疫稳态[7]。

1.1Th17细胞的功能及相关细胞因子 Th17细胞在人体固有免疫和炎症中起促进作用，尤其在自身免疫性疾病中发挥重要作用。Th17细胞主要依靠释放白细胞介素(interleukin，IL)-17A、IL-17F、IL-6、IL-22和肿瘤坏死因子-α等促炎细胞因子发挥作用[8]。IL-17家族是Th17细胞的标志性促炎因子，也是Th17细胞发挥促炎作用的主要来源，IL-17异常增加可促进炎症细胞因子的产生及募集，从而导致慢性炎症和组织损伤[9]。在多发性硬化症、类风湿关节炎、银屑病等自身免疫性疾病中均发现了Th17细胞和IL-17家族的作用[10]。IL-17的促炎作用主要通过两种途径实现：①IL-17自身即可募集免疫细胞，如中性粒细胞、单核细胞等；②IL-17协同其他促炎因子发挥作用，如肿瘤坏死因子-α、IL-1、IL-22、γ干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等[11]。IL-21是Th17细胞发挥作用的另一重要细胞因子，其本身作为促炎因子发挥作用，同时IL-21还可诱导视黄酸相关孤儿核受体γt(retinoic acid related orphan receptor γt，RORγt)在Th17细胞中的表达，促进IL-17的产生[12]。

1.2Treg细胞的功能及相关细胞因子 Treg细胞对于维持免疫动态平衡以及抑制机体的过度免疫至关重要，在自身免疫性疾病、肿瘤及器官移植排斥等疾病中发挥重要作用。Treg细胞可分为两类，即来源于胸腺的自然调节性T细胞(natural regulatory T cells，nTreg细胞)和来源于外周的诱导性调节性T细胞(peripherally-induced regulatory T cells，pTreg细胞)，其中nTreg细胞占主要部分[13]。叉头框转录因子3(forkhead box P3，Foxp3)作为成熟Treg细胞的重要标志参与Treg细胞的分化过程，Foxp3转录因子对于Treg细胞的稳定性和免疫抑制活性均至关重要[14]。有学者试图通过调控Foxp3的表达控制Treg细胞的活性，以期为自身免疫性疾病和肿瘤的治疗找到新思路[15]。Treg细胞主要通过抑制其他免疫细胞(包括树突状细胞和效应T细胞)的活性发挥免疫抑制作用，另外，Treg细胞还可分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-10等抗炎细胞因子抑制免疫应答[16]。

1.3Th17细胞和Treg细胞的分化 Th17细胞分化所必需的细胞因子主要包括TGF-β、RORγt、IL-23和IL-6。RORγt是Th17细胞分化所必需的典型转录因子，在成熟Th17细胞中独特表达[17]。有研究表明，RORγt的表达水平受多种转录因子的调节，包括缺氧诱导因子-1α、信号转导及转录激活因子(signal transduction and transcription activator，STAT)1、STAT3和STAT5[18]。

TGF-β是Th17细胞和Treg细胞分化发育必需的细胞因子。低剂量的TGF-β即可诱导Th17细胞分化，而高剂量的TGF-β在抑制Th17细胞分化的同时还可诱导Treg细胞发育[19]。TGF-β的这一调节特性在Th17/Treg比值变化中发挥重要作用。另外，IL-6与IL-23可协同TGF-β促进Th17细胞分化，但这一过程依赖于STAT3通路的激活[20]。研究表明，维生素D可通过限制IL-6的表达及其下游信号的转导抑制Th17细胞分化[21]。

nTreg细胞和pTreg细胞的分化路径不同，但最终均需表达Foxp3完成分化。nTreg细胞在胸腺中的分化主要依赖于T细胞受体与自身抗原——主要组织相容性复合物的相互作用。主要组织相容性复合物激活T细胞受体后，胸腺中的CD4+CD25+T细胞特异性表达转录因子Foxp3，并上调其他特征性因子的表达，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因以及淋巴细胞活化基因3[22]。另外，IL-2对nTreg细胞的分化也很重要。有实验表明，注射中和IL-2抗体正常小鼠胸腺中Treg细胞的数量减少，且小鼠出现自身免疫性疾病症状[23]。TGF-β联合IL-2刺激外周的CD4+CD25-T细胞，可诱导CD4+CD25-T细胞表达Smad2和Smad3细胞因子，进而激活CD4+CD25-T细胞表达Foxp3，从而完成初始T细胞向pTreg细胞的转化[24]。

综上所述，多种因素均可通过控制细胞分化打破Th17/Treg平衡。此外，在某些情况下，Treg细胞与Th17细胞也可以相互转化[25]。有研究发现，表达IL-33的树突状细胞可促使Treg细胞转化为Th17细胞[26]。

1.4Th17/Treg平衡在维持正常妊娠中的作用 在怀孕初期，母体的Treg细胞能够识别精液中的男性抗原，从而抑制母体的免疫排斥反应，增强胚胎发育和植入的能力，有助于成功妊娠[27]。怀孕初期母体的T细胞可识别并攻击胎儿，因此扩增Treg细胞、抑制免疫系统对于调节母胎耐受是必要的。既往研究表明，Th17/Treg平衡在成功妊娠中起重要作用[28]。具有抗炎作用的Treg细胞通过抑制具有促炎作用的Th17细胞，维持正常妊娠[29]。还有研究发现，只有在整个孕期进行持续的Treg细胞扩增才能有效抑制母体针对胎儿的免疫反应，同时带有妊娠印记的Treg细胞会维持母体对胎儿的保护性记忆，促进再次妊娠时Treg细胞的快速增殖[30]。研究显示，妊娠前3个月Treg细胞表达水平升高，妊娠中期Treg细胞水平达到峰值，随后逐渐降低并维持在较低水平，直至分娩后回落至妊娠前水平[31]。有研究表明，精液[32]以及生理剂量的雌激素[33]均可诱导母体内Treg细胞增殖，且Treg细胞增殖与血清雌激素水平升高呈正相关。此外，孕期母体子宫内膜基底层细胞表达CC趋化因子配体(CC chemokine ligand，CCL)22、CCL3、CCL5、CCL17和CX3C趋化因子配体1等，吸引Treg细胞进入蜕膜，诱导Treg细胞在子宫局部聚集，保护胎儿免受母体的免疫攻击[34-35]。

目前Th17细胞在母胎耐受中的作用尚不明确，但Th17细胞与许多妊娠疾病相关，包括自然流产和先兆子痫。Xu等[36]研究发现，与正常妊娠小鼠相比，流产模型小鼠的Th17细胞及相关因子IL-17、RORγt水平均升高。在正常的妊娠中，Th17/Treg比值偏向Treg细胞优势以维持妊娠，Treg细胞的减少或Th17细胞的增加对正常妊娠均不利[37]。与非妊娠女性相比，正常妊娠女性体内的Th17细胞水平较低，导致Th17/Treg比值降低[38]，这有利于维持妊娠。高度灵活的免疫调节对成功妊娠非常重要：在正常妊娠状态下，Treg细胞占据主要地位，防止母体对胎儿的免疫攻击，但在发生感染时Th17细胞则迅速增殖以增强免疫抗感染。

2 URSA与Th17/Treg失衡

2016年《中国复发性诊疗专家共识》中将RSA分为自身免疫型RSA和同种免疫型RSA，同种免疫型RSA包括固有免疫紊乱和获得性免疫紊乱两种免疫失调[1]。T细胞及其相关细胞因子异常即属于获得性免疫紊乱的范畴。研究表明，Th17/Treg失衡导致的母胎免疫耐受紊乱是URSA的病因之一[39-42]。

2.1URSA患者的Th17/Treg细胞表达模式 研究表明，URSA人群外周血和蜕膜中的Th17细胞表达升高，Treg细胞表达降低，Th17/Treg比例失衡[39-42]。早在2004年就有学者发现自然流产人群蜕膜中的CD4+CD25+Treg表达降低[43]，证明Treg细胞是维持妊娠的重要免疫细胞。另有研究发现，URSA妇女蜕膜中的Treg细胞表达降低，Th17/Treg比值显著升高[40]，表明URSA患者子宫局部Th17细胞过度增殖，Th17/Treg免疫失衡。有研究者还探讨了URSA患者外周血中Th17、Treg细胞相关细胞因子的表达，结果发现，URSA患者血清Th17相关细胞因子RORγt、IL-17、IL-21、IL-22水平均显著高于正常妊娠者，而Treg相关细胞因子Foxp3、TGF-β水平均显著低于正常妊娠者，同时URSA患者的Foxp3/RORγt比值也显著低于正常妊娠组[41-42]。以上研究表明，URSA患者子宫局部甚至全身免疫系统均处于Th17/Treg失衡的状态。

Sereshki等[44]研究发现，URSA患者体内的Th17/Treg比值会随着月经周期的变化而改变，URSA患者月经周期增殖期和分泌期Th17细胞及相关细胞因子IL-17A水平均升高，但Treg细胞水平降低，Treg细胞相关因子TGF-β、IL-10则检测不到，同时Th17/CD4+Treg比值升高，由此认为，URSA患者增殖期Th17/Treg失衡可能是其自然流产的原因之一。以上研究证明，URSA患者体内Th17细胞增加、Treg细胞减少、Th17/Treg失衡，而Th17/Treg失衡可导致母体对胎儿过度免疫，从而导致反复流产的发生。

2.2URSA患者Th17/Treg失衡的调控机制 URSA患者的Th17/Treg失衡由多种因素共同作用导致，包括基因表达、细胞因子、信号通路以及其他免疫细胞作用等。Abdolmohammadi Vahid等[45]通过测定反复妊娠丢失患者外周血中调控T细胞分化的微RNA水平发现，反复妊娠丢失患者与Treg细胞、Th2细胞分化相关的GATA结合蛋白3和抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体基因表达均下调，而与Th17细胞分化相关的转录因子T-bet和干扰素调节因子4基因表达均上调，表明Th17细胞、Treg细胞及相关微RNA谱的表达水平有望成为评估反复妊娠丢失患者预后的指标。另有研究发现，维甲酸和干扰素诱导的死亡相关基因19在URSA患者体内的表达降低，维甲酸和干扰素诱导的死亡相关基因19表达缺乏可引起活性氧类和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达上调，从而促进Th17细胞分化，同时抑制Treg细胞分化，导致Th17/Treg失衡[46]。

细胞因子及相关信号通路在调节Th17/Treg平衡中发挥了重要作用，URSA患者体内多种细胞因子表达异常均可导致Th17/Treg失衡的发生。Foxp3是Treg细胞生成所必需的细胞因子，Zhu等[47]发现，URSA患者体内Foxp3-TSDR(Treg-specific demethylated region)DNA甲基化水平升高，导致Foxp3因子表达水平降低，进而导致URSA患者体内的Treg细胞数量和功能降低。人类白细胞抗原-G是一种免疫调节因子，能够调节人体免疫细胞的分化。研究发现，URSA患者体内人类白细胞抗原-G水平降低，导致Treg细胞水平降低[48]。STAT3是Th17细胞、Treg细胞分化的重要信号转导通路，研究发现，URSA患者体内STAT3信号通路被过度激活，在抑制Treg细胞分化的同时还可促进Th17细胞分化，导致URSA患者Th17/Treg失衡加剧[49]。

细胞诱导分化也是URSA患者Th17/Treg失衡的重要调节路径之一。IL4+树突状细胞可以通过诱导Foxp3因子的表达促进Treg细胞的分化，而反复流产患者体内IL4+树突状细胞水平低于正常妊娠者，因此IL4+树突状细胞水平降低可能是URSA患者Foxp3H+Treg细胞比例降低的原因之一[50]。人绒毛膜滋养层细胞HTR8/SVneo是一种孕早期的滋养层细胞，研究表明，妊娠早期HTR8/SVneo滋养层细胞与Th17/Treg比值存在双向调节作用，将CD4+T细胞群和HTR8/SVneo滋养层细胞进行体外共培养发现，HTR8/SVneo滋养层细胞诱导分化Treg细胞的能力增强，同时还可促进Th17细胞表面凋亡标志物的表达，导致Th17细胞数量减少[51]。由此推测，URSA患者滋养层细胞分化异常造成了母胎界面Th17/Treg失衡，进而导致流产的反复发生。以上研究表明，URSA患者体内Th17/Treg失衡由多种因素共同导致，但其具体的调节网络目前尚不明确，还需要进一步研究。希望通过更深入的研究，可以明确URSA患者Th17/Treg失衡的具体机制，同时探究URSA有效治疗的靶点。

2.3Th17/Treg失衡在URSA免疫治疗中的意义 动物实验表明，糖皮质激素泼尼松可以调节大鼠体内的Th17、Treg水平，重建免疫稳态，且泼尼松的药物安全性已得到临床验证，有望应用于URSA患者的临床治疗中[52]。还有研究发现，小剂量的父系淋巴细胞免疫治疗可通过降低母体外周血中的Th17/Treg比值，维持URSA孕妇成功妊娠[53-54]，但目前其治疗的有效性和安全性还存在争议，尚需更多的临床试验验证。静脉注射用人免疫球蛋白是免疫治疗的常用药物，具有免疫替代和免疫调节的作用。Guo等[55]应用静脉注射免疫球蛋白联合肌内注射人绒毛膜促性腺激素治疗30例URSA患者，最终有18例患者成功妊娠，比较治疗前后Th17、Treg细胞水平发现，治疗后Th17细胞水平降低，Treg细胞水平升高，Th17/Treg平衡逆转，偏向Treg细胞。一项针对20例URSA孕妇的研究发现，免疫球蛋白联合人绒毛膜促性腺激素治疗能够调节URSA患者的Th17/Treg比值[56]，但该研究并未报道患者的妊娠结局，因此其确切疗效尚不可知。Ahmadi等[57]应用免疫抑制剂西罗莫司对反复种植失败的患者进行干预的随机对照试验显示，与空白对照组相比，应用西罗莫司干预患者的临床妊娠率显著升高，Th17/Treg比值显著降低，这一研究结果为URSA的治疗提供了新思路。以上研究表明，纠正Th17/Treg失衡有可能成为URSA的治疗靶点，但其有效性及安全性还有待进一步证实。

传统中医药在URSA治疗中也发挥了重要作用。有证据表明，中药方剂补肾活血汤可通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号转导通路调节Th17/Treg比值，恢复URSA患者蜕膜基质细胞的正常增殖，从而治疗URSA[58]。此外，传统中医保胎方胎元饮、寿胎丸和益肾安宫方等也可通过纠正孕妇体内的Th17/Treg失衡发挥保胎作用[59-60]。这些研究结果为补肾安胎方剂治疗URSA提供了理论依据。

3 小 结

Th17/Treg平衡对母胎免疫耐受平衡的建立与维持意义重大。Th17/Treg失衡可能导致URSA、子痫、早产等妊娠疾病的发生，因此了解Th17/Treg平衡参与胎儿母体耐受的机制、制订新的治疗策略平衡母胎界面的免疫耐受对URSA的预防及治疗均具有重要意义。与正常孕妇相比，URSA患者体循环及母胎界面的Th17/Treg失衡，且URSA患者体内Th17、Treg的表达受多种因素的调节，其具体病理机制复杂。Th17/Treg失衡是URSA患者重要的免疫标志，也可能是URSA的病因之一，但目前的研究大多处于初级阶段，还有许多问题尚待解决。相信随着研究的深入，Th17/Treg失衡导致URSA发生的具体机制将逐渐明确，并有助于寻找有效的URSA治疗方法，使广大URSA患者获益。