基于DNA三链结构的信号放大型分子逻辑门构建

庞 雪， 杨 静， 殷志祥， 唐 震，杨新木， 刘聪聪

（1.安徽理工大学数学与大数据学院，安徽淮南232001；2.上海工程技术大学数理与统计学院，上海201620）

三螺旋相互作用在调控基因表达、构建生物传感平台的分子开关、识别自然状态下双链DNA的特定序列以及操纵DNA纳米结构等方面发挥着重要作用[1-4].Du Yan[5]等人报道了一种以石墨烯-介孔二氧化硅-金纳米粒子杂化物为增强元件，以链置换DNA聚合和平行基序DNA三重体系为双重扩增，构建了一个超灵敏、选择性检测DNA的集成传感平台.2017年，Li Zou[6]将可实现信号放大的杂交链式反应（HCR）和三链体形成寡核苷酸（TFO）功能化的纳米粒子结合，构建了一个比色传感平台，用于测定包括核酸、小分子和蛋白质在内的广泛靶标.2018年，Li Zou[7]将小檗碱作为三链结构检测剂构建的无标记荧光传感平台实现了对H7N9病毒DNA和凝血酶的检测.

本研究借助HCR和荧光标记技术设计了相关生物模型来模拟逻辑与门和逻辑或门.在逻辑与门的设计中，当且仅当两个输入值都为1，即输入启动链I和TFO时，才会在溶液中检测到高背景的荧光，此时逻辑输出值记为1.其中，由于初始数据池中含有小檗碱和处于茎环结构状态下的H1、H2，启动链首先与H1、H2发生HCR，使得茎环被打开，并且三者之间按照碱基互补配对原则有序结合形成DNA双链；之后TFO与上述HCR产物DNA双链结合形成部分三链结构.由于小檗碱具有与三链结构结合显示高背景荧光的特性，因此能在反应后的溶液中检测到高背景荧光.在逻辑或门的设计中，对初始数据池中处于茎环结构状态下的H1及H2的两端都分别进行荧光和猝灭标记处理，此时由于荧光和猝灭两基团之间彼此靠近，所以溶液仅显示低背景荧光.而当向数据池中任意加入一个充当启动链角色的输入时，就会引发三者间的HCR使得H1和H2的茎环结构被打开，荧光与荧光猝灭集团也随之相互分离，从而溶液中显示高背景荧光，此时逻辑输出值记为1.

1 相关生物操作技术

由于生物分子具有纳米级的尺度、高特异性的识别和优异的信号传导能力等优点，1012个DNA分子可以放在同一个试管中；1克DNA分子与1万亿张普通CD的信息存储能力等价.同时，现代生物技术的发展使得生物分子元件组装成生物分子计算机成为可能，由此引出以DNA分子作为基本材料的DNA计算.它是一种以分子生物学作为技术基础，通过构建计算模型来解决计算问题的新型计算法.由于生物分子的高特异性识别能力，使得一次生物计算能同时处理约1018个DNA分子，是现有超级计算机计算速度的105倍；DNA分子通过聚合链式反应（PCR）便可达到2n的扩增速度，因此生产大量的DNA分子计算模型所需的成本极低；由于DNA分子计算模型靠分子力和催化剂维持运作，所以其耗能极低，仅相当于普通电脑的十亿分之一[8].DNA计算发展过程中融合了大量的分子生物技术，如DNA链置换反应、PCR、HCR、荧光标记等.

1.1 HCR

HCR作为信号放大的手段，它不需要酶的参与，操作简单，易于实现，是DNA计算中常见的生物操作技术.2012年，Chen[9]等利用HCR信号放大技术构建了超灵敏电致化学发光传感器.2019年，李朦朦[10]基于HCR设计了可以区分6种乙肝病毒耐药基因的DNA荧光传感器阵列，该阵列灵敏度高，对耐药基因的响应范围为1~20 nm，并且在进行凝胶电泳和荧光检测的实验后，验证了HCR和熵驱动信号放大联用的可行性.2019年，崔建中[11]等设计了基于HCR的0-1整数规划问题计算模型，在该模型中褪火在订书机链上的DNA发夹结构被用来表示二叉树，再通过HCR生成所有的路，设计符合条件的探针并借其逐步筛选出满足约束条件的路，最终找出最优解.2020年，刘永新[12]等将HCR与纳米材料结合实现了对核酸检测的分析总结.HCR的原理如图1所示，HCR元件包括两个部分：引发探针、两条可杂交互补并带有黏性末端的发夹型DNA（R1和R2）.当不存在引发探针时，两条发夹探针R1和R2稳定存在于溶液中.若引发探针存在时，便会触发HCR开始，于是发夹探针R1与R2被逐次打开，并交替杂交形成一条带有缺口的DNA长链，直到发夹探针R1与R2至少有一方消耗完为止.每一条这样的引发链均可以诱发HCR的发生，形成大量DNA双链作为反应产物，从而达到放大靶标信号的效果，使得检测更加可行.HCR的优点在于不需要酶的辅助，避免了非特异性扩增对分析结果的影响，反应条件温和、易控制，等温条件下经一步反应就可以实现短链DNA的扩增，并不需要复杂的仪器设备，且HCR这一信号扩增技术与各类检测技术都具有较高的兼容性.

图1 HCR原理图

1.2 荧光标记技术

荧光标记技术指利用一些能发射荧光的物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息.生物分子计算领域常常通过检测标记在基团上的荧光分子的荧光强度相对变化量来做出某种判断[13].荧光猝灭是使用荧光标记技术过程中的常用辅助，原理为荧光基团与猝灭基团之间产生的荧光能量共振转移作用，如图2所示，主要表现是：

图2 荧光标记技术原理

（1）当荧光基团与猝灭基团相互接近时，两基团之间的相互作用增强，荧光信号削弱乃至消失；

（2）当荧光基团与猝灭基团相互远离时，两基团之间的相互作用减弱，荧光信号得以重新恢复[14].

2 DNA逻辑计算模型

电子计算机中的逻辑门是具有一个或多个输入但只有一个输出的电路.不同时刻的输出状态由该时刻的输入状态决定，所以输入和输出之间具有必然的因果联系，而这种联系常用逻辑一词表示.高度特异性识别的碱基互补配对原则使得由四种脱氧核糖核酸排列组合而形成的DNA成为优秀的信息携带者，如果将电子计算机中的输入信号、输出信号和逻辑门用DNA等生物分子来表示，并在分子水平上进行逻辑操作，那么就称这样的电路为分子逻辑门.

2.1 分子逻辑与门

称“只有当决定一件事情的所有条件都成立时，事件才会发生”这种逻辑关系为与逻辑关系.在有两个输入Input A、Input B和一个输出Output的与门逻辑电路中，其逻辑真值表如表1所示.

表1 逻辑与门真值表

2.1.1 分子逻辑与门电路设计

实验材料如下：首先设计两种茎环结构DNA H1和H2，要满足二者黏性末端都含有DNA识别区域且二者碱基序列互补两个条件；接着设计一种可识别H1黏性末端的线性单链DNA作为启动链I；然后准备TFO，根据Watson-Crick配对原则，双螺旋结构的DNA链形成了一个大沟和一个小沟，TFO可高特异性地结合于双螺旋DNA富含嘌呤的大沟上[16，17]，由此形成的三螺旋可诱导DNA修复、刺激染色体上同一基因两个串联拷贝之间的同源重组[18]；最后准备小檗碱（一种植物的异喹啉生物碱），它在水溶液中几乎不发荧光，但与三链体DNA结合后会显示出强荧光[19].

在分子与门的设计中，将加入H1、H2和小檗碱的溶液作为初始数据池.在零输入的情况下，小檗碱本身呈低背景荧光.当有两个值输入时，首先启动链与H1、H2发生HCR形成双链DNA，然后TFO与双链结合形成三链结构，小檗碱识别并结合三链结构以后才会呈现出高背景的绿色荧光.根据溶液中是否能检测到高背景荧光来判断输出结果，反应结束后，若能检测到高背景的荧光，则输出结果逻辑值为1，若不能检测到高背景的荧光，则输出结果逻辑值为0.逻辑与门的操作如图3所示.

图3 逻辑与门操作示意图

与门对应的结果有四种可能：

（1）Input A=0，Input B=0时，初始数据池中不加入任何物质，小檗碱独立存在，无高背景荧光.逻辑输出值为0.

（2）Input A=0，Input B=1时，在初始数据池中加入启动链I，原本在数据池中互不影响的H1、H2由于I的加入打破了原有的平衡，I与H1的黏性末端通过碱基互补配对结合，进而打开H1的茎环结构，随之而来的是H2的茎环结构被H1打开，如此循环，直至溶液中的H1、H2至少有一方完全消耗，三者间的HCR才宣告结束.与此同时，我们将得到一条类似于交替共聚物的带切口的双螺旋DNA.但是由于没有三链结构的存在，小檗碱与双螺旋结构之间不会发生反应，所以没有高背景的绿色荧光产生.逻辑输出值为0.

（3）Input A=1，Input B=0时，在初始数据池中加入TFO，在缺乏启动链的情形下，H1、H2稳定共处，不会形成双螺旋结构，因此TFO也不会发生任何反应.于是仅仅加入TFO也没有高背景荧光产生.逻辑输出值为0.

（4）Input A=1，Input B=1时，在初始数据池中同时加入启动链I和TFO，I与H1、H2发生HCR，形成双螺旋结构DNA，再与TFO结合生成三链结构，此时大量的小檗碱结合到三链结构上，在溶液中呈现高背景荧光.只有在此种情况下与门的逻辑输出值为1.

2.2 分子逻辑或门

称“若决定一件事情的数个条件中至少有一个发生，则事件就发生”这种逻辑关系为或逻辑关系.在有两个输入input 1，input 2和一个输出的或门逻辑电路中，其逻辑真值表如表2所示.

表2 逻辑或门真值表

2.2.1 分子逻辑或门电路设计

制备两种具有茎环结构的单链DNA H1和H2，二者具有一段互补的碱基序列，且这两段碱基序列分别作为H1和H2的黏性末端.用荧光猝灭基团修饰H1的3′端和H2的5′端，再用荧光基团修饰H1的5′端和H2的3′端.将它们放置于溶液中作为初始数据池.输出结果参照反应结束后是否能检测到高背景荧光，若能检测到高背景荧光，则逻辑输出值为1，反之，则逻辑输出值为0.当不添加任何输入信号时，H1与H2在溶液中稳定共存，荧光猝灭基团与荧光基团相互接近，溶液无荧光显示，逻辑输出值为0.分别制备可识别上述H1、H2黏性末端的两种DNA单链作为Input 1和Input 2.不论是仅输入Input 1、仅输入Input 2还是同时输入Input 1和Input 2，都会有引发链与H1或H2的HCR发生，从而H1和H2的茎环结构被打开，原本靠近的荧光基团与荧光猝灭基团相互分离，进而溶液中有高背景的荧光显示.此时逻辑输出值为1.逻辑或门的操作过程如图4所示.

图4 逻辑或门操作示意图

2.3 模型分析

基于HCR扩增和DNA三链体自组装，并使用经济高效的小檗碱作为三链体指示剂，构建了逻辑与门.在输入启动链的情况下，首先会发生HCR，打开初始数据池内两种发夹DNA的茎环结构，产生了带切口的DNA双螺旋长链；此时，若溶液中存在TFO，则其会识别HCR产物并与之形成DNA三链结构，由于HCR扩增使得TFO与产物结合生成三链结构的概率变大，此为一次信号放大.由于三链结构的存在，溶液中大量的自带低背景荧光的小檗碱将自主结合到三链结构上，转而释放高背景荧光信号，使得实验结果的检测更加灵敏，此为二次信号放大.此方法没有使用染料标记核酸或嵌入双链DNA的荧光染料，而采用经济高效的小檗碱，这使得实验成本大大降低；此外生物操作过程简单无标记，两次信号放大使得结果不仅容易检测且灵敏度高.由于小檗碱对于三链结构高度选择性的响应，因此该方法在复杂的生物介质中具有巨大的潜力，为联合等温核酸扩增技术和无标记的荧光探针打开大门.

3 结论

首先，本文设计了启动链和TFO作为输入信号，利用HCR扩增和DNA三链体自组装，并借助小檗碱来检测三链结构，通过反应前后荧光强度对比来判断逻辑结果，实现了逻辑与门的构建.然后，本文利用HCR会打开发夹DNA的茎环结构，使得原发夹DNA上相互靠近的猝灭基团与荧光基团分离，同样通过反应前后荧光强度对比来判断逻辑结果，构建了逻辑或门.虽然上述方法在操作上简单易行，实验结果也相对易于检测，但用上述方法实现或非门、与非门级联来构建完整的逻辑电路还有许多不足和改进之处，这也是我们下一步的研究目标.