基于铁死亡的癌症纳米疗法研究进展

孙艺宸，肖黎明，杨莹，袁媛，于铭，叶菁,，谷雨,

(1.空军军医大学基础医学院a.学员二大队五队，b.病理学教研室，西安 710032；2.空军军医大学第一附属医院a.病理科，b.超声医学科，西安 710032)

世界卫生组织统计数据显示，2018年全球约960万人死于癌症[1]。但目前癌症的治疗效果尚不令人满意。铁死亡是一种铁依赖的、由活性氧类(reactive oxygen species，ROS)囤积及脂质过氧化导致的细胞死亡过程，也是一种新的可调控的细胞死亡形式；铁死亡的基本过程为：在二价铁离子(Fe2+)作用下，氧化物通过芬顿反应形成具有破坏性的自由基，进而催化细胞膜上高表达的多不饱和脂肪酸发生过氧化，导致细胞死亡[2]。除Fe2+外，谷胱甘肽(glutathione，GSH)耗尽或谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，Gpx4)失活也是铁死亡的调节位点。GSH是Gpx4的重要辅助因子，GSH缺失或Gpx4活性降低均可导致脂质过氧化及细胞损伤[2]。铁死亡驱动的纳米疗法是目前生物医学研究的热点。利用生物纳米技术开发的纳米给药系统(nano-drug delivery system，Nano-DDS)具有改善药物可用性、靶向给药的独特优势[3]。Nano-DDS可以很好地克服抗癌药物溶解度低、膜透性差的缺点。通过对Nano-DDS进行表面特异性修饰可实现主动靶向给药，合理设计对肿瘤刺激反应的Nano-DDS可实现位点特异性治疗作用[4]。目前，一些装载化疗药物的纳米制剂已应用于临床，如脂质体阿霉素和紫杉醇的白蛋白纳米颗粒等。现就基于铁死亡的癌症纳米疗法的研究进展予以综述。

1 铁死亡的分子机制

铁代谢和脂质过氧化是铁死亡的两个中心环节，Fe2+通过芬顿反应产生ROS，促进铁死亡的发生；而GSH缺乏和Gpx4失活可导致ROS累积，促进脂质过氧化和铁死亡发生[2]。

1.1铁代谢在铁死亡中的作用 铁是所有真核生物和大多数原核生物合成铁硫簇、血红素和其他辅因子所必需的营养物质[5]。细胞内的铁受转铁蛋白的严密调控，以维持铁稳态。细胞内大部分Fe2+储存于铁蛋白和其他含铁蛋白质中，游离Fe2+数量非常有限，细胞铁池主要以Fe2+的形式存在，也称细胞不稳定铁池；细胞铁代谢的基本过程为：①血液循环中的铁以三价铁离子(Fe3+)形式与转铁蛋白结合；②细胞通过胞膜上的转铁蛋白受体1吸收Fe3+并存储于核内体中，Fe3+在铁还原酶的催化下转变为Fe2+；③Fe2+通过核内体膜上的二价金属离子转运体释放到细胞不稳定铁池发挥生理功能，而多余的Fe2+以铁蛋白(由铁蛋白重链和轻链组成的蛋白复合体)的形式存储起来；④细胞膜上的铁转运蛋白介导铁离子的输出[2]。研究表明，干扰铁代谢可以导致铁死亡[6]。沉默转铁蛋白受体1抑制铁吸收可显著抑制铁死亡[7]。Dixon等[8]在Erastin诱导的铁死亡中发现了6个高置信度基因，包括铁反应元件结合蛋白2。抑制铁反应元件结合蛋白2的表达可上调铁代谢相关基因的表达，进而抑制Erastin诱导的铁死亡[9]。另外，RAS基因突变的细胞对铁死亡异常敏感，同时RAS基因突变可上调转铁蛋白受体1表达，下调铁蛋白轻链和重链表达，表明铁摄取增加和(或)储存减少导致的铁超载可以导致铁死亡[7]。通过铁螯合剂减少铁超载可抑制Erastin诱导的铁死亡，而外源性铁可显著增强Erastin诱导的铁死亡[8]。铁蛋白自噬降解可以产生游离的Fe2+，沉默自噬相关基因5和自噬相关基因7均可降低细胞内Fe2+水平和减少脂质过氧化，从而抑制Erastin诱导的铁死亡[10]。

活性Fe2+导致的ROS产生主要取决于芬顿反应和脂氧合酶。芬顿反应的主要过程是过氧化物与Fe2+反应产生的以氧为中心的自由基[11]。细胞内活性Fe2+水平升高，可促进ROS产生和脂质过氧化，导致铁死亡，而铁螯合剂可下调细胞内的活性Fe2+水平，减少ROS产生，抑制脂质过氧化及铁死亡[2]。此外，活性Fe2+也可以通过含铁酶产生ROS，而脂氧合酶是其中最重要的酶[12]。脂氧合酶可促进ROS产生，产生的ROS反过来又可上调脂氧合酶的表达，导致ROS水平的进一步升高[13]。

1.2GSH和Gpx4在铁死亡中的作用 除了铁超载通过芬顿反应产生ROS外，直接抑制Gpx4活性也可导致脂质过氧化和铁死亡[14]。Gpx4的功能是将脂肪酸过氧化物转化为脂肪酸醇，去除磷脂膜上的过氧化脂质[5]。因此，Gpx4是铁死亡的关键抑制因子。在脂质介导的芬顿反应中，累积的脂肪酸过氧化物生成脂质过氧化物自由基，脂质自由基可以通过摄取质子形成新的脂质过氧化物自由基，引发新一轮的脂质氧化，导致脂质间的氧化损伤不断扩散，加速脂质ROS的产生；多不饱和脂肪酸的氧化和自由基导致多不饱和脂肪酸裂解成各种产物(如丙二醛和4-羟基壬烯醛)，而过氧化多不饱和脂肪酸及其代谢产物均具有细胞毒性[5]。Ras选择性致死性小分子3可共价靶向Gpx4活性部位的硒基半胱氨酸，抑制Gpx4的活性，诱导铁死亡[15]。此外，丁硫氨酸亚砜胺(buthionine sulfoximine，BSO)也可靶向Gpx4调节铁死亡。BSO是GSH合成限速酶的不可逆抑制剂，可通过减少GSH的合成抑制Gpx4活性，升高ROS水平，促进铁死亡[16]。

GSH是Gpx4的辅助因子，因此抑制GSH产生也可导致铁死亡。胱氨酸/谷氨酸反向转运体又称System XC-，是一种跨膜氨基酸转运体，可以用细胞外的胱氨酸交换胞内的谷氨酸，从而促进GSH生成，因此SystemXC-可作为治疗肿瘤生长和存活的潜在靶点，而Erastin可通过抑制System XC-导致GSH耗竭和Gpx4失活，诱发铁死亡[5]。另一个GSH的合成途径为转硫途径，即将甲硫氨酸的硫原子转移至丝氨酸，产生半胱氨酸[17]。研究表明，敲低半胱氨酰-转运RNA合成酶可导致胱硫醚积累并上调转硫化相关基因，促进丝氨酸合成，以拮抗Erastin诱导的铁死亡[2]。

1.3脂质代谢途径在铁死亡中的作用 铁死亡最终表现为膜磷脂的过氧化，因此磷脂代谢与铁死亡密切相关。长链脂肪酸在脂酰辅酶A合成酶催化下转变为脂酰辅酶A，进而在溶血磷脂酰基转移酶(lysophosphatidyl acyltransferase，LPLAT)的作用下合成磷脂[18]。实验表明，敲除脂酰基辅酶A合成酶4和LPLAT3均可抑制铁死亡[19]。此外，甲羟戊酸途径也可以调节铁死亡。甲羟戊酸途径以乙酰辅酶A为原料合成异戊烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸，异戊烯焦磷酸是类固醇、类萜等生物分子的合成前体，对胆固醇的合成、硒半胱氨酸-转运RNA的异戊烯化以及泛醌10的产生至关重要[18]。异戊烯焦磷酸通过角鲨烯合成酶生成鲨烯，鲨烯进一步转运至内质网生成胆固醇，而抑制角鲨烯合成酶参与的胆固醇合成可以抑制铁死亡的发生[2]。相反，他汀类药物可以通过抑制异戊烯焦磷酸合成上游的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶，促进铁死亡[20]。甲羟戊酸途径促进铁死亡的机制主要为：①通过抑制异戊烯焦磷酸的合成干扰硒半胱氨酸-转运RNA的成熟，而硒半胱氨酸-转运RNA是将硒半胱氨酸嵌入Gpx4所必需[17]；②通过抑制泛醌10的产生导致线粒体的氧化损伤和呼吸功能异常[18]。

2 铁死亡驱动的纳米疗法在癌症治疗中的应用

随着对铁死亡研究的不断深入，一系列铁死亡诱导剂以及治疗策略应运而生。生物纳米技术可提高药物的扩散效率、增强药物的稳定性、改善肿瘤微环境、提升药物的药理作用、减少不良反应发生，因而可有效杀伤肿瘤细胞，且疗效更好[21]。制备成Nano-DDS的抗癌药物在提高药物利用度和靶向传递特性等方面具有显著优势：①Nano-DDS可以很好地解决抗癌药物溶解度低、膜透过性差的问题，并可增加药物通透性；②保留滞留效应，滞留效应可促进药物在肿瘤组织的选择性分布，实现抗癌药物的被动靶向递送；③对Nano-DDS进行特定的表面修饰，可以实现主动靶向运送和位点特异性治疗[22]。铁死亡与生物纳米技术相结合的治疗策略，在治疗癌症方面效果满意。

2.1诱导肿瘤细胞铁死亡的纳米疗法 通过纳米技术促进铁死亡的方法主要包括触发或促进肿瘤细胞内的芬顿反应、抑制肿瘤细胞中Gpx4的表达、外源性调节肿瘤细胞的脂质过氧化等[23]。促进肿瘤细胞内的芬顿反应、抑制肿瘤细胞中Gpx4的表达是通过调控细胞内的化学反应增加细胞内ROS的积累，而外源性调节肿瘤细胞的脂质过氧化则是通过补充外源性脂质增加细胞内过氧化脂质的聚积，促进铁死亡的发生[22]。

2.1.1促进肿瘤细胞内的芬顿反应 芬顿反应可产生羟自由基，促进脂质过氧化，导致铁死亡。临床可通过构建Nano-DDS和纳米催化系统两种方法诱导芬顿反应：①构建Nano-DDS补充过氧化氢(H2O2)和铁离子。Li等[24]将包裹H2O2和铁离子的纳米载体直接输送至肿瘤组织，以外源性补充肿瘤细胞内芬顿反应所需的H2O2和铁离子，但载体中强氧化物的过早泄漏是正常组织氧化损伤的潜在风险，安全性较差。Huo等[25]利用纳米吸附方法将天然葡萄糖氧化酶和无机催化剂超小四氧化三铁纳米粒子共负载到树枝状二氧化硅纳米结构中，构建了一种可生物降解的大孔径顺序纳米催化剂，Nano-DDS中的葡萄糖氧化酶可耗尽肿瘤细胞中的葡萄糖并产生H2O2，而H2O2作为超小四氧化三铁纳米粒子催化的芬顿反应的反应物，在随后的催化反应中产生大量有毒的羟基自由基，引发肿瘤细胞的铁死亡。②构建纳米催化系统。Huo等[26]开发的聚乙二醇化单原子含铁纳米催化剂可将铁原子分散到碳纳米材料中，在纳米粒子表面修饰聚乙二醇，使H2O2易被无定形的铁吸收和解离，在肿瘤酸性微环境下，聚乙二醇化单原子含铁纳米催化剂可引发芬顿反应，且单原子纳米催化剂的生物降解性和生物相容性良好，无任何显著的毒性反应。

2.1.2抑制肿瘤细胞Gpx4的表达 在人肝癌荷瘤小鼠模型中，二十二碳六烯酸重组的低密度脂蛋白纳米粒可引起脂质抗氧化剂Gpx4的失活和脂质过氧化，对荷瘤小鼠体内移植瘤的生长产生显著的抑制作用[22]。Wang等[27]构建的富含精氨酸的硅酸锰纳米气泡可靶向灭活Gpx4，利用硅酸锰与GSH之间的氧化还原反应清除GSH；作为硅酸锰纳米气泡的表面配体，精氨酸可用于肿瘤药物的归巢输送，在GSH耗竭之后，硅酸锰纳米气泡的降解有利于肿瘤的T1加权磁共振成像和化疗药物的按需释放，具有良好的疗效。

2.1.3外源性调节肿瘤细胞脂质过氧化 铁死亡与细胞内反应性H2O2的积累密切相关。脂质过氧化物主要来源于膜磷脂在氧化刺激下产生的多不饱和脂肪酸，外源性的脂质补充可增加细胞内过氧化脂质的积聚。口服共轭亚麻酸可以诱导三阴性乳腺癌细胞铁死亡，且具有较强活性，证明了补充外源性脂质诱导铁死亡治疗癌症的可行性，为构建相关Nano-DDS提供基础[22]。Zhou等[28]构建了基于类芬顿反应的Nano-DDS，在氧化铁纳米颗粒表面疏水性亚油酸H2O2和亲水性低聚乙二醇共同对磷酸基进行修饰，使得亚稳态的氧化亚铁和四氧化三铁在酸性条件下作为铁源按需释放Fe2+，补充外源性脂质，增加细胞内过氧化脂质的积聚，诱导铁死亡。

2.2基于铁死亡的癌症Nano-DDS治疗策略 近年来，多种药物联合应用或治疗方法的联合使用在癌症治疗中均具有显著优势。Nano-DDS可将两种及以上的药物封装到一个系统内，为联合给药提供了通用平台，也为铁死亡驱动的纳米疗法开辟了新途径[22]。

2.2.1铁死亡与光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)相结合的Nano-DDS 一些纳米材料在光处理下自身即可产生ROS。氧化石墨烯是一种具有含氧官能团的单原子层，由于其较大的边界和内部空腔，能够产生类苯基自由基。氧化石墨烯还能增强近红外处理下自由基的产生能力，是PDT的候选纳米材料。然而，氧化石墨烯在近红外光照射下产生的自由基并不能完全满足杀伤肿瘤细胞的要求。为了提高氧化石墨烯PDT的效率，He等[29]研发了基于氧化石墨烯的纳米氢氧化铁/氧化物修饰系统。在近红外光照射下，基于氧化石墨烯的纳米氢氧化铁/氧化物修饰Nano-DDS中的氧化石墨烯向Fe3+的电子转移增强，可促进Fe3+与氧气的反应，产生超氧阴离子自由基[22]。Fe3+与氧气反应也可生成H2O2，H2O2与Fe2+通过芬顿反应产生大量的羟自由基；在近红外光处理下，基于氧化石墨烯的纳米氢氧化铁/氧化物修饰Nano-DDS的ROS生成活性更强[29]。因此，基于氧化石墨烯的纳米氢氧化铁/氧化物修饰Nano-DDS在近红外光照射下可有效杀伤肿瘤细胞。基于氧化石墨烯的纳米氢氧化铁/氧化物修饰系统解决了实体瘤中低氧对PDT疗效的影响，且光敏剂的安全性良好，因此整合的Nano-DDS不良反应小，具有良好的肿瘤治疗潜力。

2.2.2铁死亡与免疫疗法相结合的Nano-DDS 癌症免疫治疗应用较广，美国食品药品管理局已批准其相关抑制剂纳武单抗用于临床[22]。癌症免疫治疗通过刺激机体的免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞，对机体正常组织的损害极小，但仍存在一些问题，如潜在的严重不良反应、仅对部分患者有反应、对实体肿瘤免疫治疗的疗效不及化疗或放疗等[30-31]。与单独免疫治疗相比，铁死亡联合免疫疗法是一种非常有前途的治疗癌症的方法[22]。铁死亡与免疫调节密切相关，CD8+T细胞可以通过释放γ干扰素下调SLC(solute carrier)3A2和SLC7A11的表达，抑制细胞对胱氨酸的摄取，促进肿瘤细胞的脂质过氧化和铁死亡[32]。Zhang等[33]构建的仿生磁小体将四氧化三铁磁性纳米颗粒包覆在白细胞膜上，并将转化生长因子-β抑制剂Ti包裹在膜内，将程序性细胞死亡受体1抗体固定在表面，静脉给药后，基于磁性四氧化三铁核心实现磁共振成像引导的药物输送；在肿瘤组织内，转化生长因子-β抑制剂Ti和Pa协同创造免疫原微环境，提高H2O2水平，从而促进铁离子参与的芬顿反应；芬顿反应产生的毒性羟自由基，可引发肿瘤细胞的铁死亡，通过死亡细胞释放的肿瘤抗原反过来促进微环境的免疫原性。

2.2.3铁死亡联合多种疗法的Nano-DDS 铁死亡联合单一的治疗方式有时并不能满足患者的个体化需求，将两种或两种以上的治疗方法与铁死亡整合到一个系统中，可以产生更好的疗效[34-35]。Bi等[36]构建的多功能Nano-DDS由上转换发光纳米粒子、铂前体药物和铁酸锌纳米粒子同时整合PDT、化疗和铁死亡来协同治疗癌症；在近红外光处理下，上转换发光纳米粒子将低能光子转化为高能光子，促进肿瘤细胞中PDT和铁酸锌纳米粒子引发的芬顿反应；同时，上转换发光纳米粒子还具有近红外激发、上转换发光、磁共振成像等特性，因此该Nano-DDS可用于癌症的多模式影像诊断和高效治疗。但每个系统的精确效应及如何精确调控、多个纳米系统之间是否存在相互作用、纳米材料的叠加是否会在人体中产生长期毒性等问题仍需进一步实验验证。

3 小 结

铁死亡作为一种新的治疗靶点，是目前肿瘤生物学和抗癌治疗的研究热点，有望成为治疗癌症的重要手段。但仍需进一步探索铁死亡发生的机制及作用靶点，充分认识由于铁死亡诱导剂的免疫原性等而导致的不良反应的机制，并有效解决因诱导剂导致的不良反应。目前基于铁死亡的Nano-DDS设计，还存在诸多问题：①基于铁死亡的Nano-DDS组成复杂，潜在的不良反应难以控制；②Nano-DDS结构精密，药物的工业化生产难度较大；③治疗费用昂贵。相信随着对基于铁死亡的Nano-DDS研究的不断深入，未来Nano-DDS可成为经济、有效的治疗策略。