食管腺癌动物模型建立方法的研究进展

吴柳盛，刘继先，乌达，李小强1，，郑于臻，罗瑞星，徐鹏程，吴定旺

(1.安徽医科大学北大深圳医院临床学院，广东 深圳 518036；2.北京大学深圳医院胸外科，广东 深圳 518036；3.安徽医科大学，合肥 230032；4.中山大学附属第六医院胸外科，广州 510655)

食管腺癌是一种常见的恶性肿瘤，多发于食管黏膜下层或贲门腺[1]，发病率仅次于食管鳞状细胞癌，预后较差。近年来，食管腺癌的发病率和死亡率均逐渐升高，引起人们的广泛关注。更多食管腺癌致癌因素的发现，促进了人们对食管腺癌的早期发现和诊疗进展，这对控制疾病死亡率起重要作用。食管腺癌患者术后化疗中常存在抗肿瘤药物的耐受情况，且肿瘤药物耐受率不断增加，给临床治疗带来一定困难。因此，需要建立一个接近人类食管腺癌临床特征的肿瘤动物模型来满足这些条件[2-3]，同时对研究食管腺癌的发病机制以及抗肿瘤药物耐受机制具有重要意义。但近年来食管腺癌动物模型只是从某单方面建模或建模方法描述不全面。现就不同类型食管腺癌动物模型的研究进展予以综述。

1 食管腺癌不同手术方式建模

食管腺癌及癌前病变模型多采用外科手术反流法进行构建，其演变过程为反流性食管炎→Barrett食管→不典型增生→食管腺癌。常见的哺乳动物包括大鼠、小鼠、兔、犬、猪等。目前SD大鼠是食管腺癌动物模型最常用的建模对象，SD大鼠食管解剖大小理想，手术实施简易方便，且SD大鼠对食管腺癌的敏感性高，在胃食管反流液的刺激下更利于诱导食管腺癌[4-5]。其他动物模型，如比格犬和猪[6]在食管腺癌研究领域也发挥重要作用，在组织结构和生理功能方面，比格犬和猪的食管与人类相似。该模型已被用于胃肠道营养的相关研究，但由于实验成本较高和动物伦理学问题较少使用。

1.1食管-胃-十二指肠混合反流模型 食管-胃-十二指肠模型的形成机制主要是胃部和十二指肠部的酸性溶液反流侵蚀食管发生病变，是用于模拟人类食管癌变常用的动物模型。然而，由于缺乏转基因的大鼠品系，该大鼠模型在机械和化学预防研究中的应用受到限制[7]。因此，食管腺癌模型以小鼠为主。有研究对实验大鼠进行食管-胃-十二指肠吻合术，术后添加铁剂喂养(铁剂能促进诱发动物食管腺癌)，结果显示，食管-胃-十二指肠吻合术后第3周和第11周，Barrett食管和食管腺癌诱导成功；术后第23周，Barrett食管的诱导率为58%，在第31周时提高至91%，而食管腺癌的诱导率分别为17%和73%[8]。在实验中，食管-胃-十二指肠吻合模型最常见，且食管腺癌动物模型的诱导率较高[9]。因此，通过手术建立大鼠食管-十二指肠吻合模型有利于深入研究抗氧化损伤和预防食管腺癌，但临床研究中较少应用。

1.2单纯十二指肠液反流模型 十二指肠液反流模型主要用于碱性肠液侵蚀食管黏膜上皮细胞诱发癌变的研究。碱性的肠液对食管黏膜进行长期慢性腐蚀可诱发癌变。多项临床研究发现，行胃大部切除术的患者随访10年后晚期并发症中有部分患者出现食管下段腺癌，提示十二指肠液反流可能诱发食管下段腺上皮癌变[10-12]。Jiang等[13]采用手术建模的方式对40只大鼠进行胃大部切除术同时吻合食管和十二指肠，术后观察大鼠食管下端腺上皮癌变率为54%。Choi等[14]和Walsh等[15]对术后大鼠进行解剖病理观察和化生腺上皮细胞研究，发现大鼠食管下端化生的腺上皮可能源于食管干细胞，这为食管腺癌的发生机制研究提供了依据。但该建模方法操作困难，直接影响术后大鼠的成活率和建模成功率。

1.3单纯胃液反流模型 单纯胃液反流模型常以比格犬作为研究对象，通过对比格犬施行贲门扩张术，胃液反流会诱导黏膜腺细胞增殖，其组织病理活检表现出早期食管炎和一些癌前病变的表型。张涛等[4]验证了以上观点，采用酸性的胃液长期侵蚀食管黏膜上皮致黏膜屏障受损，进而发生食管溃疡出血、水肿狭窄以及癌前病变等，其中以Barrett食管发病率最显著。动物实验中小鼠受损的食管黏膜出现水肿溃疡、增生以及赘生物的形成，管腔狭窄、管壁变厚等肉眼可观病理表现。通过手术来构建胃食管反流模型诱导食管腺癌较常见[16]，但特异性差，观察时间长，较少应用。

1.4食管灌注动物模型 食管灌注动物模型指通过人造食管导管置于动物体内，灌注酸性液体来模拟胃酸反流，通过酸性液体对食管腺上皮的不断刺激和损害来诱导食管腺癌模型的构建。这种食管灌注动物模型实验对象有家兔、大鼠、小鼠等[17]。皮下植入大鼠渗透压微泵的灌注模型可以精确控制灌注的浓度和流量[18]。因此，一些学者针对不同的实验对象建立了食管灌注模型，结果发现酸性液体会直接造成食管黏膜腺上皮损伤，进而诱导食管腺上皮发生癌变[19]。该建模方法在实验中较少应用，属于自然性诱发动物的食管发生癌变，外部影响因素多，诱发时间较长，不适合短期研究。

2 食管腺癌不同药物建模

目前化学致癌剂(以亚硝胺类为代表)诱导食管腺癌动物模型的技术趋向成熟和完善，常用甲基苄基亚硝胺(nitrcxsomethylbenzylamine，NMBA)作为致癌剂。国外文献报道，NMBA是诱发动物食管腺癌较为理想的化学制剂，对食管有较高的亲和性和特异性[20-21]。其优点是诱导的动物食管腺癌病理特性与人食管腺癌细胞的发生顺序相平行，药物剂量较小，毒性较弱，该类动物模型操作简易。亚硝胺类物质构建食管腺癌模型的给药方式包括自由取食法、食管内灌注及皮下注射法。亚硝胺建模方式的癌变诱发率高，该类动物模型可以用来研究食管腺癌的发病机制和临床预后疗效评估。同时该类建模技术特异性差[22]，目前化学试剂诱癌模型还存在诸多限制，如诱癌成功率低，建模时间长，不同物种和个体间肿瘤的差异较大，所表现出来的肿瘤形态特征多样，不适宜作为临床肿瘤药物治疗的动物模型研究。在药物诱发的食管腺癌模型中，实验动物与致癌因子直接或间接接触。该建模方式操作简便，肿瘤诱发率高，动物成瘤效果好，可肉眼观察到整个食管黏膜发生癌变的病理过程。

2.1NMBA喂养法 亚硝胺是强致癌物，也是最重要的化学致癌物之一。NMBA是亚硝胺的种类之一，消化系统肿瘤(如食管癌)的发生与饮食中亚硝胺的摄入量相关。邹丽辉[23]采用NMBA灌喂SD大鼠的建模方式成功诱导了食管腺癌，选取3～4周龄体重约80 g的大鼠，每5只一组，NMBA储存液用蒸馏水稀释，使用溶度为200 μg/mL，剂量为1 mg/kg，每周连续灌喂3次，持续3个月，其中半个月后，每一个月处死5只大鼠，诱癌及收集标本时间为38周，整理SD大鼠食管病理组织活检报告发现食管炎→不典型增生→原位癌→腺癌的动态病理变化过程。NMBA喂养法是化学致癌物诱导食管腺癌动物模型构建领域中最常用的一种方法，具有操作简便、成本较低、实验偏差较小、可行性高等优势[24-25]。

2.2对甲基戊基亚硝胺喂养法 对甲基戊基亚硝胺是亚硝胺中的一种常见亚型，常用作化学致癌剂诱发癌变，进而构建相对应的肿瘤模型。邹晴晴等[26]将对甲基戊基亚硝胺作为大鼠(MRC-Wistar品系)食管腺癌的诱变剂，药物剂量为12.5～25 mg/kg，每周给药1次，给药周期持续12周，并持续给予大鼠饮水17～20周，后期处死大鼠并进行病理切片处理和苏木精-伊红染色，病理结果显示食管、鼻腔和肺部组织出现乳头状瘤、癌前病变和浸润癌变，表明癌变诱发率较高，病理变化与人类相似。对甲基戊基亚硝胺喂养法在食管腺癌动物建模的基础研究中也是较为常用的一种方式，动物建模成功率较高，实验周期较短，可节省大量时间和成本[27-28]。

2.34-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4-NQO)喂养方法 4-NQO是一种水溶性喹啉衍生物[29]，最初是应用于诱导动物口腔癌模型的化学致癌物。有研究表明，4-NQO也能诱导小鼠(NOD/SCID品系)发生食管腺癌，且致癌率较高，建模效果好[30]。但4-NQO喂养模型的药物剂量大，诱癌周期时间长，毒性大，成本高，特异性较差，致癌物质常会诱导其他器官发生癌变，实验偏差大，目前较少应用。Abdel-Rahman等[31]将105只C57BL/6小鼠随机分为3组，分别用100、50、10 μg/mL的4-NQO溶液供小鼠自由饮用，实验过程中发现剂量为100 μg/mL组的小鼠不良反应最明显，在32周病变进一步发展，出现明显的原位癌和进展期食管腺癌病理表现。在诱导食管腺体发生癌变过程中，随着4-NQO浓度升高，食管腺癌发生率也升高。但在4-NQO所构建的肿瘤动物模型也存在一定的局限性，即小鼠自由饮用4-NQO溶液，无法确定每只小鼠具体的4-NQO暴露剂量[32]。

3 食管腺癌不同移植建模

移植肿瘤的动物模型被广泛应用，且是筛选和研究新的抗肿瘤药物的最常用模型。这种移植方法介于细胞培养和小鼠肿瘤模型之间，称为“动物培养”。移植性的动物模型构建有同种移植和异种移植两种方式。但同种移植食管癌动物模型能获得的鼠食管癌细胞系较少，其应用受到一定限制[33]。异种移植食管癌动物模型是最常用的食管癌动物模型之一，该模型具有较高的肿瘤形成率，并可以反映肿瘤侵袭、生长和药物敏感性的特征。移植的食管腺癌动物模型可以模拟人体内的肿瘤微环境，研究人体内食管腺癌的发生和进展[34]。早期的研究大多使用异位移植模型[35]，其具有制备成功率高和肿瘤形成快的优点，但经常发生浸润和转移，从而限制了进一步的研究应用。

3.1细胞系建立的食管腺癌动物模型 肿瘤细胞系的同种异体动物模型在细胞毒性药物的研发中发挥重要作用。其优点是接种特定肿瘤细胞可以诱导同种异体肿瘤，生长速度相对一致，个体差异小，接种存活率接近100%，容易客观地判断疗效，可以连续移植到同一只动物中，且保留时间长，实验周期短[36]。常用于食管腺癌的细胞株包括EC109、KYSE510、Casel7等[37]，各细胞株来源不同，所以增殖、侵袭、转移及基因水平均不同。相关研究报道[38-39]，多数的食管腺癌细胞系经过体外多代传递培养后，细胞系可能会出现突变情况，其组织学特征不稳定，无法还原和体现之前食管腺癌患者的多样性和个体化，因此在食管腺癌机制研究中的应用受限。

3.2免疫缺陷食管腺癌小鼠模型 因正常小鼠对肿瘤存在免疫排斥反应，造成肿瘤在普通小鼠上种植的成功率不高，因此对于肿瘤动物模型的构建需要专门的免疫缺陷小鼠作为载体。Abdel-Rahman等[31]首次成功建立食管腺癌肿瘤组织移植模型，高度还原了肿瘤在体外培养的动态发展环境，目前仍是前沿的肿瘤动物模型技术。Ceylan等[32]和Schellnegger 等[33]首先使用人食管腺癌细胞系成功建立小鼠皮下异种移植肿瘤。免疫缺陷食管腺癌小鼠模型可高度模拟食管腺癌患者肿瘤细胞的生长环境，但不同个体间对抗肿瘤药物的敏感性和耐受性存在差异，这种方法可以有效避免临床上食管腺癌患者的个体差异[40]。同时医务工作者还可以利用该模型进行抗肿瘤药物试验，患者评估疗效后再接受靶向治疗，可以制订出有前瞻性和预见性的治疗方案，改善患者的生活质量并延长其生存时间。

3.3人源化食管腺癌小鼠模型 近年来随着肿瘤免疫治疗研究的快速发展，肿瘤免疫浸润也成为研究热点。人源化小鼠模型是指携带有功能性的人类基因，能体现出人类肿瘤微环境特征的小鼠模型[41]。有研究报道，食管腺癌裸鼠模型病变特征与人类相似，近交系组织相容性好，肿瘤移植效果较佳，可用于筛选抗肿瘤药物以及进行肿瘤耐药机制学研究[42]。Ceylan等[32]利用移植的手段将人体食管腺癌细胞或组织接种于动物体内建立食管腺癌的动物模型，并通过异种移植将食管腺癌组织或癌细胞植入除食管外的实验动物的其他部位。

3.4基因工程食管腺癌小鼠模型 随着人们对基因工程和生物技术研究的深入，食管腺癌内源性的发生机制研究成为人们关注的热点。Matsumoto等[34]第一次通过将纯化的DNA与小鼠胚胎原核相结合，成功获得了转基因动物。随着基因编辑技术(CRISPR/Cas9)的发展，现已形成一套成熟的基因工程技术体系[35]。基因工程小鼠模型对现代癌症研究具有重要意义，为肿瘤治疗提供了个性化诊疗方案和思路，同时为基因工程的转基因小鼠提供了一个可预测的模型，用来测试癌基因是否可以导致生物体内正常细胞在正常情况下致癌，基因工程食管腺癌动物模型是研究食管腺癌内在因素的最佳选择。

4 体内外肿瘤动物模型前沿技术

免疫荧光成像技术是目前肿瘤分子生物学研究中常用的影像学辅助技术。在肿瘤动物模型的构建中，这种活体成像技术能够通过无创的方式动态观察体内成瘤情况，包括大小、位置以及肿瘤侵犯范围等，大大节省了实验时间和成本，有利于提高科研效率。Lee等[36]的研究方向是目前肿瘤动物模型构建的最前沿技术——可视化原位人源肿瘤模型[37]构建。可视化原位人源肿瘤模型通过对SD大鼠进行肿瘤细胞的原位皮下移植，最大限度地还原患者机体内肿瘤的动态环境变化，后期通过绿色荧光蛋白/荧光素酶成像技术呈现其发展趋势[23]。该模型的构建极大地推动了临床肿瘤的个性化治疗和精准治疗，特别是食管腺癌术后化疗中不同个体对抗肿瘤药物耐受机制的研究[43]。柏文等[12]使用无创生物体内成像方法监测食管腺癌裸鼠肿瘤模型，并成功构建了绿色荧光蛋白/荧光素酶双标记人食管腺癌ECA109细胞系(ECA109-荧光素酶-绿色荧光蛋白)，其原理是采用动物活体成像技术观察食管腺癌细胞在动物模型中的生长和转移。Chen等[39]提出将绿色荧光蛋白/荧光素酶双重标记技术用于体内成像监测，这结合了两种成像技术的优势，扩大了体内成像的应用范围。此外，绿色荧光蛋白/荧光素酶双重标记技术与体内成像技术相结合，在食管腺癌的裸鼠肿瘤模型上进行动态观察研究[40]，以可视化了解食管腺癌细胞的生物学行为和特征。这种活体成像技术为食管腺癌治疗药物的研发、肿瘤耐药性和基因治疗效果验证等提供了新思路。

5 小 结

随着近年来免疫工程和基因工程的快速发展，肿瘤动物模型的构建技术越来越成熟。肿瘤动物模型从早期的化学致癌剂亚硝胺类毒物诱发动物食管腺癌模型的形成到目前的可视化原位人源肿瘤模型的成功构建，更加精准地模拟肿瘤在人体内生长环境，随着相关技术的成熟和发展，肿瘤动物模型的构建更加个性化、更有针对性、更加精准化。对食管腺癌肿瘤动物模型构建并进行活体的动态示踪[42-43]，清晰了解食管腺癌动态的生物学行为，能够快速、精准、个性化地建立理想的肿瘤动物模型，可为食管腺癌抗癌药物的研发、临床诊断和治疗以及预后评估等提供新思路。实验动物人源化[44]是近年的研究热点，期望通过人源化实验动物来构建肿瘤动物模型，在一定程度上高度还原肿瘤的生长环境。