亚高温环境下番茄对细菌性斑点病病原菌的抗性变化及其机制研究

王安然 史军营 胡璋健 王 娇 喻景权 师 恺

（浙江大学农业与生物技术学院，浙江杭州 310058）

番茄（Solanum lycopersiumL.）是我国重要的蔬菜作物，适宜生长温度是20～25 ℃（王桂莲和王佩圣，2019），但在栽培过程中由于季节、气候或设施封闭覆盖，常会遭遇28～35 ℃的亚高温环境，不仅会抑制叶、花、果实等器官的生长发育（赵玉萍 等，2010），还会影响番茄对病原菌的抗性，严重影响番茄的安全生产和经济效益（Hwang et al.，2000；Velásquez et al.，2018）。

番茄细菌性斑点病在我国南北方的番茄栽培中均有发生，严重时发病率可达80%以上；其病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringaepv.tomato，Pst）主要为害番茄叶片，也为害茎和果实（宋加伟 等，2016）。Pst菌株PstDC3000 在2003 年完成基因组解析后，常作为模式病原菌广泛应用于植物抗病性和细菌致病机制的研究（Buell et al.，2003）。

通过对植物与PstDC3000 互作系统的研究发现，植物防御病原菌主要通过两条抗病途径：一是依赖于植物细胞膜表面的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）感知病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）后激发模式触发的免疫（PAMPstriggered immunity，PTI），如番茄和拟南芥的FLS2（flagellin-sensing 2）蛋白可通过对细菌鞭毛蛋白22 个保守基序flg22 的识别，诱发下游抗病响应（Tsuda et al.，2008）；二是由植物细胞内R 蛋白（resistance protein）专一识别病原菌效应因子后诱发效应蛋白触发的免疫（effector-triggered immunity，ETI），如番茄R 蛋白Pto 特异识别PstDC3000 效应蛋白AvrPto 和AvrPtoB，激发下游强烈的防御信号，显著提高对细菌性斑点病病原菌的抗性（Oh &Martin，2011；Peng et al.，2018）。上述两条抗病途径都可引起下游活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆发，水杨酸（salicylic acid，SA）积累，防御基因诱导表达等一系列抗性响应（Peng et al.，2018）。

植物PTI 和ETI 均会受到亚高温的影响，但前人的研究结果不尽相同。例如，拟南芥的PTI 在28 ℃亚高温中会受到抑制，对PstDC3000 的抗性显著下降（Wang et al.，2009）；但Cheng 等（2013）的研究则发现拟南芥中PTI 相关基因FRK1（flg22-induced receptor-like kinase 1）和WRKY29转录因子基因的表达及相关蛋白MAPK（mitogen-activated protein kinase）和BIK1（botrytis-induced kinase 1）的激活在28 ℃亚高温时显著增强。拟南芥中识别PstDC3000 效应因子的R 蛋白RPS2 和RPM1 的表达量并不受亚高温的影响，但二者介导的ETI 信号途径却受到亚高温的抑制（Cheng et al.，2013）；在番茄作物中已发现含有抗叶霉病病原菌的Cf-4、Cf-9和抗南方根结线虫的Mi-1等R 基因（resistance gene，R gene）的抗性种质会分别在高于33 ℃和28 ℃的亚高温环境中出现抗性衰退乃至丧失的现象（de Jong et al.，2002；Hu et al.，2015）。但PstDC3000 引起的番茄细菌性斑点病是否会受到亚高温的影响还并不清楚，亚高温对番茄PTI 和Pto基因介导的ETI 的影响及其机制亦缺乏研究。

本试验以含有Pto基因的抗PstDC3000 的番茄LA3472 和其背景基因型Moneymaker 为材料，研究亚高温对番茄PTI 和Pto基因介导的ETI 两种抗病途径的影响；通过2 份番茄材料内源SA 含量及SA 生物合成与信号转导基因表达量的变化，探究亚高温影响番茄抗病性的内在机制，以期为亚高温下番茄病害防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及亚高温处理

试验于2018——2020 年在浙江大学农业与生物技术学院蔬菜研究所温室和实验室进行。供试番茄来源于Tomato Genetics Resource Center，为含有Pto基因的抗性基因型LA3472 和其背景基因型Moneymaker（编号为LA2706）。浸种后，将番茄播种在含有基质（草炭、蛭石和珍珠岩体积比为6∶3∶1）的营养钵（直径10 cm）中，其生长条件为：昼夜温度24 ℃/21 ℃，相对湿度70%～80%，光周期12 h/12 h，平均光强600 μmol·m-2·s-1。

待番茄长至五叶一心时，对大小、长势一致的植株进行亚高温处理，昼夜温度为30 ℃/27 ℃，以昼夜温度24 ℃/21 ℃的常温为对照。其他条件与处理前保持一致，即：相对湿度70%～80%，光周期12 h/12 h，平均光强600 μmol·m-2·s-1。每个处理10 株，3 次重复。

1.2 病原菌培养及接种

PstDC3000 菌种由浙江大学宋凤鸣教授实验室惠赠，参照Zhang 等（2015）的方法保存和培养。对亚高温及常温处理24 h 后的植株接种PstDC3000：菌株在King’s B（KB）固体培养基上进行活化培养后，用10 mmol·L-1MgCl2调节菌液至OD600≈ 0.01，并加入有机硅至0.03%起展渗作用，均匀喷施于处理植株每片复叶背面，不接种病原菌的对照（Mock）组以相同方式喷施10 mmol·L-1MgCl2；每个处理10 株，3 次重复。接种后的植株分别置于常温（24 ℃/21 ℃）和亚高温（30 ℃/27℃）环境下继续培养；其他条件设置为：光周期12 h/12 h，平均光强600 μmol·m-2·s-1，相对湿度90%。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 病原菌体外培养生长曲线的绘制 为探究不同温度处理对PstDC3000 自身增殖的影响，将500 μL 相同浓度（OD600≈ 1.0）的PstDC3000 菌液加入50 mL KB 液体培养基中，置于试验材料处理温度（24 ℃和30 ℃）的摇床（200 r·min-1）上进行培养，测定不同培养时间后菌液OD600的变化，绘制生长曲线。每个温度下4 瓶菌液，3 次重复。

1.3.2 叶片菌落数（colony-forming units，CFU）测定 病原菌接种60 h 后，在不同处理植株的从下往上充分展开的第3 或第4 片功能叶上随机打取6 个直径为9 mm 的叶圆片，将叶圆片在70%酒精中浸泡10 s，用无菌水冲洗2 遍，参照Wolfe 等（2000）的方法处理并计算叶片单位面积上的菌落数。每个处理3 株，3 次重复。

1.3.3 病情指数（disease index，DI）统计 病原菌接种84 h 后，参考杨子祥等（2014）的分级标准统计处理叶片发病情况，调查植株从下往上充分展开的第3、4、5 片功能叶的所有小叶，每个处理调查5 株，3 次重复。每片小叶按发病症状轻重程度分为5 个等级，分级标准为：0 级，叶片正常无病斑；Ⅰ级，叶片下表皮可见少数病斑；Ⅱ级，叶片下表皮局部有密集病斑；Ⅲ级，叶片下表皮多部位有密集病斑，但未散布整片叶；Ⅳ级，叶片下表皮全片叶可见病斑分布。计算单株病情指数。

DI=∑（各级病叶数×相应级数）/（调查总叶数×最高级数）× 100

1.3.4 叶绿素荧光成像及测定 病原菌接种84 h后，将处理植株暗适应0.5 h，选取不同处理植株的从下往上充分展开的第3 或第4 片功能叶，用IMAGING-PAM 调制叶绿素荧光成像系统（Heinz-Wal，德国），参照Genty 等（1989）的方法测定被处理叶片的光系统Ⅱ（Photosystem Ⅱ，PS Ⅱ）实际光化学效率ΦPSⅡ。每处理3 株，3 次重复。

1.3.5 SA 含量测定 病原菌接种24 h 后，参考Zhang 等（2018）的方法测定叶片SA 含量。取0.1 g 从下往上充分展开的第3 或第4 片功能叶片冻样充分研磨，用2 mL 内参标样D4-SA（OlChemIm，捷克）终浓度为100 ng·mL-1的乙酸乙酯溶解，经氮气吹干后，用500 μL 70%甲醇复溶并离心，参照王峰（2017）的方法，使用安捷伦1290 高效液相色谱系统及安捷伦6460 三级串联杆质谱仪（Agilent Technologies，德国）对上清液进行检测，测定叶片中SA 含量。每个处理3 株，3 次重复。

1.3.6 叶片总RNA 提取及qRT-PCR 分析 病原菌接种24 h 后，使用RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，中国）提取50～100 mg 从下往上充分展开的第3 或第4 片功能叶片总RNA，使用Fermentas RevertAid first Strand cDNA Synthesis kit反转录成cDNA。qRT-PCR 以番茄肌动蛋白Actin为内参基因，测定SA 生物合成基因PALs 与信号转导基因NPR1的相对表达量，使用iCycler iQ Multicolor 实时定量PCR 检测系统仪器（Bio-Rad，美国），参照说明书进行操作。根据SGN 上的番茄基因序列设计引物（表1），数据采用2-∆∆CT法进行分析（Livak &Schmittgen，2001）。每个处理3 株，3 次重复。

表1 qRT-PCR 分析所用引物

1.4 统计方法

采用SAS 8.0 软件对各处理进行在5%水平上（Tukey 法）的差异显著性分析，运用OriginPro 2019b 进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 不同温度对Pst DC3000 体外生长的影响

为了探究不同温度对PstDC3000 自身生长的影响，将相同浓度的PstDC3000（OD600≈ 0.01）分别置于24 ℃常温和30 ℃亚高温的摇床上进行培养，测定不同时间点的菌液浓度，绘制生长曲线（图1）。结果表明，2 种温度下PstDC3000 的增殖速度并无显著差异，说明体外培养时，与24 ℃常温相比，30 ℃亚高温对PstDC3000 的生长并无显著影响。

图1 温度对Pst DC3000 体外生长的影响

2.2 亚高温对番茄细菌性斑点病发生的影响

如图2-A、2-B、2-C 所示，相比于常温，亚高温下Moneymaker 和LA3472 叶片感病表型均更加严重，叶片菌落数均显著增多，病情指数均显著增加。

植物叶片光系统Ⅱ（PSⅡ）对各种逆境胁迫的响应较为敏感，故PSⅡ的实际光化学效率ΦPSⅡ可以作为衡量叶片受胁迫程度的重要指标（岑海燕等，2018）。如图2-D、2-E 所示，在未进行病原菌接种的Mock 条件下，亚高温处理对Moneymaker和LA3472 番茄叶片ΦPSⅡ的影响并不显著；但在接种PstDC3000 后，Moneymaker 的ΦPSⅡ在常温下和亚高温下分别降低了0.145 和0.197，即亚高温使Moneymaker 接种后的受胁迫程度比常温下加重了36%；LA3472 在接种病原菌后，常温处理的ΦPSⅡ仅降低了0.065，而亚高温处理的ΦPSⅡ则降低了0.124，即亚高温使LA3472 接种后的受胁迫程度比常温下加重了91%。上述试验结果表明，单独的亚高温处理不会对Moneymaker 和LA3472 叶片造成胁迫，但亚高温处理会加重PstDC3000 造成的生物胁迫，即亚高温增加了抗性不同的2 份番茄材料对PstDC3000 的敏感性，且对LA3472 的抗病性的抑制更为明显。

图2 亚高温对番茄接种Pst DC3000 后叶片表型（A）、叶片菌落数（B）、病情指数（C）和ΦPSⅡ（D、E）的影响

2.3 亚高温对番茄接种Pst DC3000 后SA 含量及合成基因PALs 表达量的影响

植物响应病原菌后会诱导SA 合成关键酶苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）编码基因上调表达，进而促进SA 的生物合成和积累（Kim &Hwang，2014）；SA 则通过绑定NPR1（nonexpresser of PR genes 1）蛋白进入细胞核中，激活下游病程相关基因（pathogenesis-related genes，PR genes）的表达（Mou et al.，2003）。为探究亚高温是否影响不同抗病路径中的SA 信号途径，首先对番茄PTI 和ETI 响应中SA 含量及其合成基因PALs 的表达量进行测定。

接种PstDC3000 后，常温下Moneymaker 和LA3472 叶片中的SA 含量均显著上升，亚高温环境下虽然SA 含量也有一定程度的上升，但亚高温显著抑制了SA 在2 份番茄材料中的积累，Moneymaker 和LA3472 叶片的SA 含量分别比常温对照下降了50%和58%（图3）。

图3 亚高温下番茄接种Pst DC3000 24 h 后SA 含量

qRT-PCR 结果表明，接种PstDC3000 后，接种后Moneymaker 的PALs 基因显著上调，但在亚高温下的上调幅度低于常温；LA3472 的PALs 基因在常温下受PstDC3000 诱导后的表达也均显著增加，但在亚高温下，除PAL10在接种病原菌后显著上调外，PAL4、PAL6、PAL8、PAL9和PAL11在接种后的表达与Mock 条件下无显著差异（图4）。这与SA 含量的变化趋势一致。说明在2 份番茄材料中PstDC3000 诱导的SA 积累和合成基因PALs 的表达在亚高温下均受到了抑制。

图4 亚高温下番茄接种Pst DC3000 24 h 后PALs 的基因表达量

2.4 亚高温对番茄接种Pst DC3000 后SA 信号转导基因NPR1 表达量的影响

在亚高温和常温下接种PstDC3000 后，Moneymaker 和LA3472 中SA 信号转导基因NPR1的表达情况与SA 含量和PALs 基因表达的变化趋势相似（图5）。Moneymaker 和LA3472 中NPR1的表达量在接种PstDC3000 后均显著增加，但在亚高温下表达量均显著低于常温，说明2 份材料中NPR1的表达也都受到了亚高温的抑制。

图5 亚高温下番茄接种Pst DC3000 24 h 后NPR1 的基因表达量

3 讨论与结论

病原物、寄主植物和环境条件构成了植物“病害三角”，温度是影响病原菌致病力与植物抗病性的重要环境因子。研究表明，番茄的适宜生长温度为20～25 ℃（王桂莲和王佩圣，2019），而PstDC3000 病原菌的适宜生长温度为24～30 ℃（杨春泉，2008）。因此本试验选取了24 ℃和30 ℃两个环境温度为代表，用以研究亚高温环境下番茄对细菌性斑点病病原菌的抗性变化及其内在机制。试验发现，与24 ℃常温相比，30 ℃亚高温对PstDC3000 在培养基中的自身增殖速度没有明显影响，但会使2 份番茄材料叶片内PstDC3000 的菌量均显著增加，这与前人在拟南芥中的研究结果一致（Huot et al.，2017）。说明亚高温可能通过调控番茄的抗病性导致细菌性斑点病的发生或加重，而和病原菌本身的生长特性无关。

前人研究表明，亚高温对植物抗病性的影响体现在对PTI 和ETI 的复杂调控。本试验中，高感番茄Moneymaker 和高抗番茄LA3472 在亚高温下均表现出更严重的发病程度，叶片受胁迫程度均比常温下加重，说明番茄的PTI 和Pto基因介导的ETI都受到了亚高温的抑制。该结果与Wang 等（2009）对拟南芥基础免疫的研究结果相一致，可能与亚高温下抗病信号传递和抗性相关基因表达发生改变有关。Janda 等（2019）发现高于28 ℃的亚高温处理会抑制拟南芥中受flg22 诱导的ROS 爆发，且抑制效果随处理时间的延长和温度的升高而增强，并认为这可能与亚高温处理后FLS2的转录受抑制和细胞膜上FLS2 蛋白含量的减少有关。然而，Cheng等（2013）却发现28 ℃亚高温处理会增强拟南芥PTI 相关蛋白BIK1 的磷酸化，且PTI 标记基因WRKY29和FRK1受flg22 的诱导表达在28 ℃亚高温时最为显著。因此，亚高温对PTI 的影响还需要在更多的植物-病原互作系统中深入研究。而亚高温对ETI 的影响会因R 基因种类和病原菌特性而异（Velásquez et al.，2018）。本试验发现亚高温降低了番茄Pto基因介导的其对PstDC3000 的抗性，与前人在番茄与其他病原系统互作的报道相一致。例如：Cf-4、Cf-9等R 基因介导的番茄对叶霉病病原菌的抗性在33 ℃亚高温下会受到较大程度的抑制，与质膜上识别病原菌效应因子Avr9 的高亲和性结合位点减少有关（de Jong et al.，2002）；抗南方根结线虫的Mi-1基因在高于28 ℃的亚高温环境中不表达或延迟表达（王银磊 等，2014；Hu et al.，2015），其介导的对根结线虫的抗性也完全丧失（Hwang et al.，2000）；具有抗番茄黄化曲叶病毒基因Ty-1/Ty-3的番茄品种9706TR 在25～33℃亚高温环境中的病毒积累量比在20～23 ℃常温环境中显著增加（李佳蔚 等，2016）。

SA 在植物PTI 和ETI 响应中均有重要的作用（Vlot et al.，2009），且其介导的抗病信号途径受到温度、光照、湿度、CO2浓度等环境因素的调控（Zhou et al.，2004；Hua，2013；Zhang et al.，2015）。例如高浓度CO2可促进SA 的合成和信号转导，增加番茄对PstDC3000 和烟草花叶病毒的抗性（Zhang et al.，2015）；16 ℃亚低温可通过增强拟南芥SA 合成与信号途径，提高其对PstDC3000 的抗性（Li et al.，2020）。而在拟南芥和烟草中都发现SA 合成相关基因EDS1（enhanced disease susceptibility 1）和信号途径标记基因PR1会受亚高温影响而呈现较弱的病原诱导表达水平，且30 ℃的亚高温处理会使拟南芥中SA 的积累与信号传递受阻，降低其对PstDC3000 的基础抗性（Zhao et al.，2016；Huot et al.，2017）。在 番 茄抗叶霉病病原菌的Cf-4、Cf-9基因介导的ETI 响应中，SA 信号转导基因NPR1的表达在33 ℃亚高温下也会受到抑制（de Jong et al.，2002）。本试验中Moneymaker 与LA3472 的SA 含量对PstDC3000 的响应均受到亚高温的抑制，PALs 基因在亚高温下的表达量也显著低于常温对照，而PAL 在辣椒和烟草等茄科植物受病原菌诱导的SA合成与积累中起着重要作用（Chen et al.，2009；Seyfferth &Tsuda，2014）。2 份番茄材料中SA 信号转导基因NPR1在病原诱导下的表达也均受到亚高温的抑制。这些结果与在拟南芥、烟草的基础免疫和番茄Cf基因介导的ETI 中SA 含量变化及相关基因的表达趋势一致，说明SA 参与亚高温对番茄PTI 和Pto基因介导的ETI 的调控，推测SA 的合成与信号传递受抑制是番茄抗病性在亚高温下降低的原因。

综上，亚高温下番茄PTI 和ETI 均被削弱，2份番茄材料对细菌性斑点病的敏感性都显著增加；亚高温抑制PTI 和ETI 中SA 的合成及信号转导过程，可能是抗性不同的番茄对PstDC3000 的敏感性均增加的原因。而SA 是否参与亚高温对番茄其他R 基因介导的ETI 的调控还有待探究，不受亚高温影响的抗病途径也值得挖掘。因此，在实际生产中，一方面要利用农艺措施尽量避免作物栽培中出现诱发或加重病害的亚高温环境，另一方面也可结合化学、生物手段防控亚高温环境下番茄病害的发生。