分子标记技术在药用植物上的应用现状与金钱草的研究进展

郑子洪， 周曼佳， 何祥玉， 罗佳雯， 程汝滨*

(1.浙江九龙山国家级自然保护区管理中心， 浙江 遂昌 323300； 2.浙江中医药大学 药学院， 浙江 杭州 310053)

药用植物种质资源是保障其可持续发展的核心，也是中医药发展的基础，但是随着社会需求的迅速增长，导致药用植物资源过度消耗，同时市场上也存在许多混伪品掺杂的现象，严重影响药用植物的临床用药效果。因此，寻找高效稳定的方法，对药用植物及其混伪品进行鉴别，以推动药用植物的可持续发展需求迫切。分子标记技术作为一项速度快、特异性强和灵敏度高的技术，可快速准确地鉴别植物品种及促进其系统发育分析等方面的深入研究。ZHOU等[1]基于掌叶大黄、药用大黄和唐古特大黄的叶绿体基因组开发出潜在DNA条形码并成功验证，为超级DNA条形码在大黄中的应用奠定基础。植物叶绿体基因组全序列具有独特的高度保守结构，因其碱基替换率低、单亲本遗传特性使其在植物的系统分类、品种鉴定和系统发育分析中具有特殊的优势。CHEN等[2]研究表明，6种橐吾属植物的全基因组可能成为有效鉴定其物种的超级条形码。金钱草为植物过路黄的干燥全草，具有清热解毒，利尿排石，活血散瘀之功效，可治疗肝胆结石、胆囊炎和水肿等。目前，药材市场上的药材品种繁多，同名异物等现象导致其质量不高，各物种原植物形态、药材性状方面极为相似，近缘混伪品较多、真伪难辨，造成药材质量不稳定。为同类研究及临床应用提供依据，概述了DNA条形码、限制性片段长度多态性(RFLP)和扩增片段长度多态性(AFLP)等方面概述了分子标记技术在药用植物研究上的应用及金钱草的地方习用品与市场混用品、化学成分和药理作用等的研究进展，并展望了其未来的研究方向。

1分子标记技术在药用植物上的应用现状

DNA分子标记具有分布范围广、标记数量多、性状稳定且选择便利、操作简单和检测迅速等优点，近年来已广泛应用于药用植物的分析鉴定。目前，分子标记技术对药用植物研究提供了技术保证，其种类已有10余种，如DNA条形码、限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)和简单重复序列(SSR)等，给药用植物研究提供技术保证。而叶绿体基因序列具有独特的高度保守结构，比传统的DNA条形码具有更强的分辨力和更好的通用性，具备成为物种鉴定超级条形码的潜力。

1.1DNA条形码

DNA条形码(DNA barcoding)是通过利用一段短的、较保守的标准DNA序列进行物种鉴定的分子技术，其优点是操作简单、能快速准确鉴别大量样本、结果不受外界环境影响等，实现药用植物的快速准确鉴定，推动了DNA条形码技术在药用植物方面的应用，是药用植物分子鉴定方法上的重大创新[3]。近年来，DNA条形码技术在药用植物各方面的应用越来越广泛。INTHARUKSA等[4]研究发现，条形码基因rbcL、ITS、ITS1和ITS2与psbA-trnH的组合可以准确区分不同的诃子属药用植物，且ITS2与psbA-trnH的DNA条形码组合鉴别效果最好。张宏意等[5]研究发现，psbA-trnH序列分析可从分子水平上对德庆道地种源何首乌与其他种源何首乌进行有效鉴定和区分。JIN等[6]对400种兰科植物DNA序列分析并结合聚类分析结果表明， rbcL可单独或结合其他基因片段用于兰科植物的遗传多样性研究，且兰科植物的遗传多样性丰富。

1.2限制性片段长度多态性(RFLP)

限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)是一种以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记。该技术由于等位基因呈共显性，且标记数量多和稳定性高，已广泛应用于药用植物鉴定和亲缘关系分析等。梁晋军等[7]对柿及其亲缘植物关系分析发现，柿与金枣柿的亲缘关系最缘，与美洲柿和乌柿的亲缘关系较远。SHI等[8]基于105种白头翁属植物和其常见掺假物的植物样品，建立ITS2条码库，并开发出快速特异性PCR-RFLP鉴定检测方法，为快速鉴别市售白头翁产品提供技术支撑，有助于保证其中药产品的安全使用。

1.3扩增片段长度多态性(AFLP)

扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)是RFLP和PCR技术相结合的产物，其特点是在知道DNA信息的条件下，专用引物能准确地对酶切片段进行PCR扩增，AFLP具有分辨率高、稳定性好且灵敏度高的优点可用于亚种分化和种间关系的研究。刘晓莹等[9]对212个广藿香样本进行AFLP分析显示，广藿香种间具有较为丰富的遗传多样性，种内遗传多样性相对较小，种间遗传分化显著，可为广藿香优良种质的筛选等研究提供参考依据。苏增一等[10]对不同产地益智样本进行AFLP-PCR扩增，筛选出4对适合于益智AFLP分析的引物，且E3/M7引物组合效果最佳，能够鉴定不同产地益智的种质资源。

1.4单核苷酸多态性(SNP)

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)主要指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，这是一种检测遗传多样性和保护育种者权利的有用的基因分型工具，可用于药用植物的道地性评价，有望成为最有效的分子标记技术。乔东亚等[11]以85份紫薇种质为样本材料进行简化基因组测序，筛选出高质量的SNP标记，获得SNP分型数据，紫薇种质资源遗传多样性丰富，不同类群间存在较高的基因流。WANG等[12]通过检测的单核苷酸多态性(SNP)位点设计2个经过修饰的特异性引物，用于陈皮和果皮的多重等位基因特异PCR系统鉴定。SNP分析在药用植物物种鉴定，道地性和遗传多样性研究等方面的应用前景广阔。

1.5简单重复序列(SSR)

简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)又称微卫星标记，是指基因组中由1～6个核苷酸为基本单位，经重复串联多次构成一段DNA重复序列。其优点是数量多，重复性、信息量和多态性高。因而SSR通常应用于分子指纹图谱构建、物种品种鉴定和分子辅助育种等。刘亚令等[13]对380个黄芪样本进行SSR遗传多样性及结构分析显示，药用黄芪具有较高程度的遗传多样性水平，且2种黄芪的遗传变异主要发生在居群内部，为药用黄芪种质资源的有效利用、遗传多样性保护、育种及开发优质黄芪种质资源提供一定的理论基础。LU等[14]利用EST-SSR和SRAP技术构建铁皮石斛和杜仲杂种图谱，为遗传学研究提供了基础，并有助于石斛品种育种计划中医学性状的定位和标记辅助选择研究。基于SSR分子标记构建的指纹图谱及遗传多样性研究，可为药用植物种质资源的深入研究奠定基础。

1.6叶绿体全序列分析

叶绿体基因组是叶绿体内相对独立的遗传物质，由于其高度保守性、进化速率较慢的特性，使其成为不同物种间的分类鉴定研究的重要工具，为后期药用植物新条形码的开发提供了条件。近期有研究发现，叶绿体在药用植物方面的应用有道地性遗传研究、物种鉴定以及系统发育等，也可用于筛选出高变区作为潜在的分子标记。姜丹[15]研究表明，在不同地区黄芩中，黄芩道地产区的遗传多样性高于非道地产区，且道地产区是黄芩的遗传多样性中心，可对黄芩及其他道地药材的可持续利用提供依据。张明英等[16]比对分析了10种柴胡属叶绿体基因组结果表明，叶绿体全基因组可准确鉴定柴胡属植物。CHEN等[17]基于16种叶绿体基因组构建的ML和MP进化树，可有效鉴别3种麻黄属植物，表明叶绿体基因组具有成为物种鉴定超级条形码的潜力；同时发现，麻黄属植物与买麻藤属植物、百岁兰具有更近的系统发育关系。TAN等[18]从皂荚和山皂荚的130个基因中鉴定出SSC区域的ycf1b核苷酸变异性最高，明显高于植物通用标记区域rbcL、ndhF、rpl16、trnL-trnF、trnL intron、psbA-trnH和matK，揭示ycf1b作为DNA条形码候选区域的潜能。利用叶绿体基因组以开发新的DNA条形码，可提高金钱草及其他药用植物质量鉴定的有效性和准确性，可促进其系统发育及道地性研究。

分子标记技术的快速发展和叶绿体全序列的深入研究，对于药用植物资源的研究影响较大。除前述几种常见标记技术外，还有RAPD、ISSR、SRAP、CAPS和STS等分子标记技术也在药用植物各方面的研究中具有重要的技术支撑作用。分子标记间各有优势与不足，与AFLP、RAPD等技术相比，SSR和ISSR具有多态性更高更丰富，表明单一的某种标记技术在药用植物研究领域的局限性。多种技术的结合产生的新的标记技术使得药用植物资源研究更加准确和全面，分子鉴定在理论和方法上日趋成熟。

2金钱草的研究

正品金钱草药材为报春花科珍珠菜属植物过路黄(LysimachiachristinaeHance)的干燥全草，又名大金钱草、对座草、路边黄和遍地黄等，味苦，酸，微寒。具有清热解毒、利尿排石和活血散淤等功能。近年来，中药材市场销售及临床应用上经常发现金钱草地方习用品和混用品被当作金钱草正品药材使用，造成金钱草质量和安全性得不到保障，给临床应用造成安全隐患，降低其治疗效果。

2.1地方习用品与市场混用品

全国各地金钱草地方习用品和市场混用品众多，因此识别主要地方金钱草习用品和混用品，才能正确区分鉴别正品金钱草。在市场上除金钱草正品外，其地方习用品和混用品众多，据不完全统计，目前至少有7科14种植物被作为金钱草在各地使用，常见的地方习用品和混用品包括点腺过路黄、天胡荽、活血丹、广金钱草、马蹄金和积雪草。近年研究发现，其同属植物聚花过路黄和巴东过路黄等也作为金钱草伪品在市场上流通。

点腺过路黄为报春花科植物点腺过路黄的全草，因其性味归经和功能主治与正品金钱草相似，在浙江地区作金钱草使用。天胡荽及其变种白毛天胡荽，为伞形科植物天胡荽的全草，又称破铜钱，在江西地区被当作金钱草使用，功效更偏向治痢疾，利水作用强，可治目翳。活血丹为唇形科植物活血丹的干燥地上部分，又称大叶金钱草和连钱草，在上海和江苏地区作为金钱草地方习用品。这是因为其生境与药效与过路黄相似，也常生于路边荒地湿气大的地方，可利水通淋治结石。广金钱草是豆科植物，其地上部分在湖南及两广地区作为金钱草混用品使用，其在治疗泌尿系统结石方面效果更佳。马蹄金为旋花科植物马蹄金的全草，又称小金钱草，在永州地区作金钱草混用品使用，其功效与金钱草的最大差别是马蹄金对结石无治疗作用。积雪草为伞形科植物积雪草的全草，在湖南永顺地区为金钱草混用品，与金钱草相比，积雪草在清热解毒方面效果更好。聚花过路黄和巴东过路黄与金钱草来源于同科同属，是金钱草的混伪品，因其形态相似，在四川地区易被当作金钱草使用。金钱草习用品和混用品与金钱草正品存在较多方面的不同，两者混淆使用会对金钱草的临床应用造成隐患。因此，迫切需要寻找快速鉴别不同地区金钱草习用品和混用品的方法。

2.2化学成分

金钱草的功效与其化学成分组成相关，金钱草的初步分析得出其含有酚类、黄酮类、甙类、鞣质、挥发油、氨基酸、胆碱、甾醇、氯化钾和内脂类等成分，其中黄酮类化合物研究较为深入[19]。沈联德等[20]从金钱草分离得到六个黄酮类化合物，此外，还分离出两种无机盐结晶，检验出其中具有硝酸盐的存在。赵世萍[21]等还分离出尿嘧啶和对羟基苯甲酸。侯冬岩[22]等用水蒸气-萃取法提取金钱草挥发性成分发现主要为樟脑、山奈酚和石竹烯醇等。

2.3药理作用

金钱草的药理作用广泛，具有利尿通淋、除湿退黄等功效，其对治疗肝胆结石效果显著，是治结石之要药。YANG等[23]研究发现，金钱草提取物体内具有明显的抗胆囊炎和利胆活性。金钱草还具有利尿[24]和镇痛[25]作用。王萍等[26]采用体外模拟的技术，使用 SEM，FT-IR和 XRD等检测方法对提取的晶体研究发现，金钱草具有排石作用。此外，金钱草还具有抗氧化和抗菌等药理活性[27]。金钱草药理作用的深入研究，不仅有利于金钱草的临床治疗应用，还为金钱草药品开发方向和提高利用效率提供科学依据。

2.4临床应用

金钱草在中医临床上应用广泛，常用于治疗结石、黄疸型肝炎、慢性前列腺炎、尿潴留和慢性胆囊炎等[28]。据文献记载，诸多排石中药配方中金钱草均为君药，是治疗结石(膀胱结石、胆囊结石等)的有效中草药。齐鹏[29]研究表明，以金钱草为主药，对急性黄疸型肝炎、慢性前列腺炎、慢性胆囊炎和尿潴留4种病症进行治疗，其治愈率高。金钱草临床应用范围极广，药用价值极高，具有安全性高、价格实惠、资源丰富等特点，应当加强对金钱草临床应用的研究，充分发挥其医疗功效。

2.5产品开发

金钱草药品因其良好功效在市场上销售应用广泛，据统计，约有99种中成药中使用金钱草。此外，为提高金钱草的临床治疗效果，有以金钱草药剂配伍其他中成药的治疗效果良好。其中，中成药中药金钱草冲剂具有清热解毒和利尿排石作用，既可清热利湿，又可解毒通淋，同时可减少晶体形成，对于膀胱湿热、尿路感染、尿路结石和肾绞痛等有良好的辅助治疗作用。复方金钱草颗粒具有清热祛湿，利尿排石，消炎止痛，用于治疗泌尿系统结石和尿路感染等[30]。氧氟沙星与金钱草冲剂联合治疗尿路感染和复杂性尿路感染，可显著提高治疗的有效率[31]。清热利胆片组方中的金钱草具有清热利胆功效，适用于急性单纯性胆囊炎、轻度化脓性胆囊炎、急性胆源性胰腺炎、胆管炎和胆道术后综合征等[32]。金钱草开发应用较广，其制成的中成药较多，市场销售量大，是良好的中成药制备药材，但由于其习用品和混用品的存在药品质量降低，应探究其更好的鉴别技术，以提高金钱草药品在临床上的应用效果。

3展望

分子标记技术和叶绿体全序列在现代药用植物种质资源与道地性评价、亲缘关系分析与正伪品鉴定等领域应用广泛，有利于促进中医药产业的可持续发展。但是，多数分子标记方法耗时耗力，不利于推广和实际应用，且在DNA的研究中，使用的基因片段多为ITS、matK、rbcL和psbA-trnH等，对其新型片段的开发应用较少，仍无法对部分疑难物种进行鉴别[33]。因此，后续研究应建立省时省力、节约成本的分子标记技术，同时更加注重特异性强的位点或片段，以开发出新型片段。同时，金钱草药用价值高，但其市售质量参差不齐，且金钱草及其习用品和混伪品的临床应用存在差异，滥用可能会造成不良影响，其常见鉴别方式有性状鉴别、显微和薄层色谱，但易受技术及条件等的影响，鉴别效率不高。因此，亟待探寻高效准确的方法对金钱草及其习用品和混用品的质量进行鉴别。以期分子标记技术结合叶绿体全序列分析技术能够探寻出金钱草的特征性DNA片段，利用其对金钱草及其混伪品进行快速区分，提高鉴定准确性，为临床用药和后续应用提供指导。