中药和食品中大豆异黄酮分析方法的研究进展

徐 硕，金鹏飞，徐文峰，吴学军，姜文清(北京医院药学部，国家老年医学中心，中国医学科学院老年医学研究院，药物临床风险与个体化应用评价北京市重点实验室，北京 100730)

大豆异黄酮是以3-苯并吡喃酮为母核的化合物群，其中主要成分有6种，分别是大豆苷(daidzin)、黄豆黄苷(glycitin)、染料木苷(genistin)、大豆苷元(daidzein)、黄豆黄素(glycitein)和染料木素(genistein)[1-2]。大豆制品因加工方法不同，其中异黄酮含量存在差异，发酵大豆食品以不含糖苷异黄酮为主，配糖体异黄酮含量较低，而非发酵食品和大豆粉的异黄酮含量高于一般传统大豆食品的2～3倍，以大豆苷和染料木苷为主[3]。大豆异黄酮的化学结构与人体内分泌的雌激素雌二醇(E2)很相似，能在一定条件下表现出类似雌激素的生物活性，对内分泌与代谢系统疾病具有良好的调节改善作用[4]，可预防心血管疾病、延缓衰老、降低乳腺癌和前列腺癌等疾病的发病率、缓解更年期雌激素分泌减少而引起的停经期综合征和骨质疏松症、抗氧化和降低胆固醇等[3，5-8]。因大豆异黄酮具有重要的生物活性，有必要对其进行深入研究。本文对近年来中药和食品中大豆异黄酮的分析方法进行综述。

1 大豆异黄酮的分析方法

1.1薄层扫描法 徐艳春等[9]利用薄层扫描法，建立了红曲及其制剂血脂康中大豆苷元的含量测定方法。样品用体积分数为75%的乙醇提取后过氧化铝柱，用体积分数为75%的乙醇洗脱，将洗脱液蒸干，用氯仿-甲醇(2∶1)定容。以环己烷-乙酸乙酯-甲醇(5∶4∶0.7)为展开剂，硅胶GF254预制板，UV 254 nm处观察荧光淬灭斑点，结果大豆苷元与其他成分分离良好，可以定量。扫描条件为：测定波长λS=295 nm，参比波长λR=350 nm，双波长反射法锯齿扫描，线性化系数SX=7。结果显示，大豆苷元点样量在0.1～0.5 μg范围内线性关系良好，平均回收率为98.7%，相对标准偏差(RSD)为5.00%。

周晓霞[10]建立了测定中药葛根、粉葛中大豆苷元含量的薄层扫描法。样品用甲醇提取，以硅胶G板为薄层吸附剂，展开剂为三氯甲烷-无水乙醇(10∶1)，在激发波长λex=260 nm处扫描大豆苷元色谱峰的荧光强度。结果显示，大豆苷元的点样量在0.048 8～0.244 0 μg范围内与其薄层荧光扫描色谱峰面积呈良好的线性关系，测得葛根、粉葛样品中大豆苷元的含量分别为0.323%，0.059 8%。

1.2紫外分光光度法 张玉梅等[11]通过紫外分光光度法，建立了一种检测食物中大豆异黄酮含量的快速分析方法。以金雀异黄素(即染料木素)为对照品，在其紫外最大吸收峰259 nm波长处测定大孔吸附树脂法配合溶剂法提取制得的大豆异黄酮试样的含量，结果试样中总异黄酮的含量以金雀异黄素计算为38.7%，平均回收率为99.86%，RSD值为2.6%，适用于保健食品中大豆异黄酮的含量测定。

付钰洁等[12]利用紫外分光光度法，建立了检测大豆提取物中大豆异黄酮含量的快速分析方法。以葛根素为对照品，在其紫外最大吸收峰250 nm波长处测定，脱脂大豆粉样品采用超声波循环回流提取25 min，提取液经高速离心，取上清液用蒸馏水稀释后进行分析。结果显示，葛根素质量浓度在2.0～60.0 mg·L-1范围内呈良好线性关系，样品的平均回收率为99.87%，RSD值为1.04%。

1.3高效液相色谱(HPLC)法 Mitani K等[13]采用管内固相微萃取结合HPLC技术(in-tube SPME-HPLC)，建立了自动在线检测大豆苷元、染料木素、大豆苷和染料木苷的方法。管内固相微萃取(SPME)是一种从水溶性样品中提取有机化合物的新技术，通过样品溶液的重复抽吸或喷射循环，将待分析成分直接从样品中置于开放的管状毛细管中。采用Zorbax Eclipse XDB-C8柱，以甲醇-水为流动相，梯度洗脱，检测波长为255 nm，4种待测成分可在8 min内完全分离。为优化待测成分的提取工艺，对SPME参数进行优化。待测成分质量浓度在5～200 ng·mL-1范围内线性关系良好，相关系数(r)大于0.999 9，检测限为0.4～0.5 ng·mL-1，平均回收率高于97%。该方法可成功应用于大豆食品的分析。

王剑波等[14]建立了测定槐角提取物中染料木素含量的HPLC法。样品采用甲醇超声提取，采用Luna C18柱，流动相为甲醇-水(60∶40)，检测波长为260 nm，结果显示，染料木素质量浓度在40.2～201.0 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为98.93%，RSD值为0.81%。

苏菊等[15]应用HPLC法建立了测定保健食品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的方法。采用Waters Spherisorb ODS-2柱，以甲醇-冰醋酸水溶液(40∶60)为流动相，检测波长为254 nm，结果显示，4种成分均在1～50 μg·mL-1范围内线性关系良好，平均回收率为85%～110%。

郑玲等[16]建立了测定峨嵋葛根中染料木素的HPLC法。采用Kromasil C18柱，流动相为甲醇-20 mL·L-1乙酸(47∶53)，检测波长为254 nm，结果显示，染料木素质量浓度在4.07～40.72 μg·mL-1范围内线性关系良好，平均回收率为102.3%，RSD值为0.76%。

Wang L J等[17]采用HPLC法测定了豆豉中的大豆异黄酮的含量，比较了加工过程中不同氯化钠用量对豆豉中大豆异黄酮含量和组成的影响。样品中加入体积分数为80%的甲醇，以索氏提取法提取，采用Dikma Diamonsil C18柱，流动相为1 mL·L-1乙酸-乙腈(含1 mL·L-1乙酸)，梯度洗脱，检测波长为254 nm。结果表明，当氯化钠含量为100 g·L-1时，生大豆中有61%异黄酮损失，在发酵前和发酵后分别损失43%，18%。虽然在豆豉加工过程中预处理不会对总异黄酮含量产生影响，但异黄酮的组成会发生改变，苷元含量增加，而相应的β-葡萄糖苷、丙二酰葡萄糖苷和乙酰葡萄糖苷含量降低，以苷元形式存在的异黄酮在发酵后超过总含量的90%。

吴向阳等[18]建立了能同时测定野葛的根、茎及叶中葛根素、大豆苷和大豆苷元的HPLC法。样品用体积分数为70%的乙醇超声提取，采用Hypersil ODS-2色谱柱，流动相为甲醇-水，梯度洗脱，检测波长为250 nm。葛根素、大豆苷和大豆苷元质量浓度分别在11.87～73.91，1.00～6.48，0.28～1.53 μg·mL-1范围内呈良好线性关系，最低检出限分别为0.43，0.24，0.18 μg·mL-1，平均回收率分别为99.78%，102.61%，105.57%。该方法测得葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分别为3.98%，0.36%，0.039%，高于药典中提取方法的提取率。葛茎中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分别为0.004%，0.003 2%,0.000 7%，葛叶中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量分别为0.001 6%，0.005%，0.001 2%。

李艳艳等[19]建立了能同时测定豆类中大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素4种大豆异黄酮成分含量的HPLC法。样品用体积分数为70%的乙醇超声提取，采用Phenomenex C18柱，流动相为乙腈-2 mL·L-1甲酸，梯度洗脱，检测波长为260 nm。结果4种成分的线性范围为0.167～33.300 μg，平均回收率在98.95%～100.02%范围内，RSD值在0.89%～1.58%范围内。

蒋明哲等[20]利用HPLC法测定大豆制品类保健食品中染料木素和大豆苷元的含量。样品用体积分数为80%的乙醇提取，采用ODS-C18柱，流动相为甲醇-水(45∶55)，检测波长为260 nm，染料木素和大豆苷元分别在8.0～100.0，1.0～80.0 μg·mL-1范围内线性关系良好，平均回收率分别为98.5%,98.1%。

王晓娟等[21]建立了能同时测定大豆提取物中6种大豆异黄酮即大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素含量HPLC法，采用Welchrom C18柱，以甲醇-水-乙腈(35∶65∶8)(磷酸调节pH值至2.6～3.0)为流动相，检测波长为254 nm。结果显示，各成分的线性关系良好，平均回收率在100.45%～102.75%范围内，RSD值在1.10%～1.89%范围内。

李艳等[7]建立了能同时测定河北黄豆、豆腐、豆豉等7种豆类及豆制品中染料木苷、染料木素和大豆黄素含量的HPLC法。采用Platisil ODS柱，以甲醇-水(5.5∶4.5)为流动相，检测波长为260 nm。结果显示，染料木苷、大豆黄素和染料木素分别在11.47～172，5.33～80，8.26～124 μg·mL-1范围内线性关系良好，平均回收率分别为98.9%，98.7%，99.4%，RSD值分别为0.3%，1.8%，2.9%。

张啸环等[22]考察了用不同辅料炮制淡豆豉对其大豆异黄酮含量的影响。淡豆豉样品利用发酵法进行制备，色谱柱为Hanbo C18柱，流动相为甲醇∶水∶冰醋酸(40∶60∶0.5)，检测波长为260 nm。结果显示，大豆苷与染料木苷分别在0.03～0.17，5.22～31.32 μg范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为99.4%，99.3%，RSD值分别为0.81%，0.96%。以大豆苷为考察指标，辅料为青蒿、桑叶、人参和淫羊藿时，3种样品含量差异较小，与青蒿、桑叶比较，淫羊藿和人参为辅料发酵的淡豆豉含量略低；以染料木苷为考察指标，与青蒿、桑叶比较，淫羊藿为辅料发酵的淡豆豉含量略有升高，人参为辅料发酵的淡豆豉含量明显升高。

杨艳等[23]建立了能同时测定纳豆中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素6种大豆异黄酮含量的HPLC法。通过考察不同的样品前处理方法，用正交实验设计确定最佳提取条件为：乙醇体积分数为70%，提取时间为60 min，提取温度为60 ℃,料液比为1∶50 g·mL-1。采用Agilent Eclipse plus-C18柱，以甲醇-5 mL·L-1乙酸为流动相，梯度洗脱，检测波长为254 nm。结果显示，6种成分的线性关系良好，大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的检出限分别为0.037，0.034，0.028，0.019，0.026，0.025 μg·mL-1，平均回收率在95.5%～102.8%范围内。

曹明舰等[24]建立了测定豆浆中的大豆苷、染料木苷和大豆苷元3种大豆异黄酮含量的HPLC法，对不同豆水比的豆浆前处理条件进行优化，将干豆浆粉用体积分数为80%的甲醇在50 ℃条件下超声提取30 min，采用C18柱，流动相为甲醇-2 mL·L-1醋酸(1∶1)，检测波长为260 nm。结果显示，3种成分线性关系良好，大豆苷、染料木苷和大豆苷元的平均回收率分别在98.98%～104.44%，99.16%～104.42%，102.01%～106.65%范围内。

张鹏等[25]建立了能测定千斤拔药材中染料木苷和染料木素含量的HPLC法。样品用体积分数为50%的乙醇加热回流提取，色谱柱为Kromasil 100-5 C18柱，以乙腈-1 mL·L-1磷酸为流动相，梯度洗脱，检测波长为260 nm。结果显示，染料木苷和染料木素质量浓度分别在17.483～279.720,4.088～65.406 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率分别为104.27%，97.16%，RSD值分别为2.61%,5.54%。不同产地千斤拔药材中染料木苷和染料木素的含量有明显差异，所建立的方法为千斤拔药材的质量评价与开发利用提供了科学依据。

邓青等[26]利用HPLC法对黑豆汁制何首乌、生何首乌、清蒸制何首乌中的大豆苷元进行定量分析。采用Diamonsil C18柱，流动相为甲醇-2 mL·L-1磷酸-乙腈(2∶6∶2)，测定波长为254 nm。结果显示，大豆苷元在1.65～16.56 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为 98.72%，RSD值为1.54%。黑豆汁制何首乌大豆苷元含量为12.34±1.26 mg·g-1，在生何首乌、清蒸制何首乌中未检测出大豆苷元。该方法可有效区分黑豆制何首乌与其他炮制品，从而对制何首乌进行质量评价与鉴别。

1.4超高效液相色谱(UPLC)法 王华林[27]建立了能快速测定大豆中染料木素、大豆苷元、大豆苷和染料木苷含量的UPLC法。样品中加入体积分数为70%的乙醇超声提取，提取液经浓缩后，用乙腈-2 mL·L-1乙酸溶解，用UPLC法分析。采用Acquity BEH C18色谱柱，流动相为乙腈-2 mL·L-1乙酸，梯度洗脱。结果显示，4种大豆异黄酮的线性范围均在1.0～9.0 μg·mL-1范围内，平均回收率在97.8%～98.7%范围内，RSD值在1.3%～2.1%范围内。

柴川等[28]建立了能同时测定淡豆豉中大豆苷元、黄豆黄素和染料木素3种异黄酮苷元的UPLC法。采用Acquity BEH C18色谱柱，流动相为乙腈-1 mL·L-1甲酸(24∶76)，样品经体积分数为80%的甲醇提取后，用UPLC-UV分析，检测波长为260 nm。结果显示，3种成分均可在5 min内完全分离并实现定量分析，大豆苷元、黄豆黄素和染料木素在相应的质量浓度范围内线性关系良好，平均回收率分别为 100.5%，99.06%,97.84%。

1.5液相色谱-质谱联用(LC-MS)法 陈岑等[29]建立了以加速溶剂萃取-高效液相色谱-电喷雾-离子阱质谱(ASE-HPLC-ESI-IT/MS)联用技术分析淡豆豉中大豆异黄酮类化合物的方法。采用加速溶剂萃取仪，淡豆豉用体积分数为70%的乙醇提取，色谱柱为XAqua C18柱，以乙腈-1 mL·L-1甲酸为流动相，梯度洗脱。离子阱质谱分别采用正、负离子模式下扫描，鉴定淡豆豉中的大豆异黄酮类成分，结果共鉴定出9种结合型糖苷类大豆异黄酮化合物。

Lee M J等[30]建立了能快速分离、鉴定和定量分析大豆和大豆制品中12种异黄酮成分的高效液相色谱-电喷雾-飞行时间-质谱(LC-ESI-TOF-MS)法。根据各化合物的准分子离子、钠或钾加合物离子、碎片离子、同位素离子的准确质量数据，对大豆异黄酮进行结构鉴定。采用Symmetry C18柱，以甲醇-0.5 mL·L-1甲酸为流动相，梯度洗脱，正离子模式扫描，结果大豆制品中的12种不同异黄酮可在12 min内实现完全分离、鉴定和定量分析。结果显示,测定成分在0.01～20.00 mg·mL-1范围内线性关系良好(r2> 0.992)，检测限为10～40 ng·mL-1，定量限为3～132 ng·mL-1。所建立的方法无明显的基质效应，能够作为同时测定大豆异黄酮的有效分析方法。

冯薇等[31]采用MTT比色(MTT)法对淡豆豉和黑豆乙醇提取物进行促大鼠颅骨成骨细胞增殖活性研究，并通过高效液相色谱-二极管阵列检测-电喷雾-串联质谱(HPLC-DAD-ESI-MS/MS)技术分析两者的化学成分。采用Agilent Eclipse Plus-C18柱，流动相为乙腈-5 mL·L-1甲酸，梯度洗脱，检测波长为261 nm，电离源为电喷雾离子源(ESI)，正离子方式检测。结果显示，淡豆豉和黑豆乙醇提取物对大鼠成骨细胞的促增殖率分别为 36.5%，28.2%，主要有效成分为异黄酮类化合物，经LC-MS分析，鉴定出15个黄酮类成分。黑豆发酵成淡豆豉后的成分变化主要体现在由苷类成分脱糖转化为苷元，含量显著增加的大豆苷元和染料木素2种苷元主要是由丙二酰大豆苷和丙二酰染料木苷脱丙二酰基和葡萄糖转化而来。

2 结语

目前中药和食品中大豆异黄酮的分析测定方法包括薄层扫描法、紫外分光光度法、HPLC法、UPLC法和LC-MS法，主要以定量分析为主，其中HPLC法是大豆异黄酮定量分析中使用最为广泛的技术，具有分离性能高、分析长度快和定量准确的优势。薄层扫描法具有分离效能高、快速、简便等特点，但其精密度、准确度和重复性不如HPLC法。紫外分光光度法的优点是仪器设备简单、操作简便、灵敏度高，但其准确度相对不高。

HPLC的常用检测器为二极管阵列检测器(DAD)，色谱柱采用C18柱，流动相多采用甲醇-水、甲醇或乙腈-乙酸溶液系统，也有少部分采用甲醇-水-乙腈、甲醇-磷酸溶液-乙腈三相系统，检测波长通常选择250～260 nm，样品多采用体积分数为70%或80%的甲醇或乙醇提取。与HPLC法相比，UPLC法具有分析时间短、实验效率高等特点，但在大豆异黄酮的定量分析中应用相对较少。LC-MS法将色谱对复杂样品的高分离能力与质谱具有高选择性、高灵敏度及能提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，可在短时间内对样品中的大豆异黄酮进行定性和定量分析。虽然大豆异黄酮的分析方法取得了一定进展，但也存在一些问题。现有研究大多数是对中药和食品中的1～6种大豆异黄酮进行定量，不能全面评价药材质量，需要加强同时对更多种指标成分进行定量分析的研究，实现对样品中主要大豆异黄酮成分和微量成分的同时定量分析。对大豆异黄酮成分的分析方法进一步深入研究，对中药和食品的质量控制具有重要意义。