浅谈蜂王浆中抗生素残留检测方法

王 琦，陈东海，王进州，张 发，王 志

（吉林省养蜂科学研究所，吉林 吉林 132108）

抗生素是由微生物或高等动植物在低浓度下分泌的小分子天然有机化合物，是能够干扰其他细胞发育功能的化学物质[1]，具有一定的抑菌或杀菌作用。抗生素按照化学结构大致可分为β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、氨基葡糖苷类、大环内酯类、多肽类等[2]；而按照用途又可分为人用抗生素和兽用抗生素两种，被广泛应用于医疗、畜牧业、水产养殖等领域。蜂病是蜜蜂养殖业的棘手问题之一，而抗生素的出现大大降低了蜂病所带来的损失。如美洲幼虫腐臭病、白垩病、微孢子虫病等蜜蜂常见疾病均可通过抗生素得到有效控制或治疗。

有研究表明，抗生素类药物的吸收率并不高，约有85%的抗生素会经受药者新陈代谢而排出体外[3]。蜂王浆是经由蜂巢内哺育蜂的头部腺体分泌到体外的分泌物，因此在蜂王浆生产期间（或前不久） 使用抗生素类药物，可使抗生素残留在蜂王浆内。陈昌利等[4]研究发现，给蜂群饲喂250 mg 四环素后50 d，蜂王浆中的四环素残留才能完全达标，土霉素则需要60 d。虽然按照规定用法定量使用抗生素能够将蜂王浆内的抗生素含量控制在合格（安全） 水平，但在养蜂生产上滥用抗生素的现象却层出不穷[5]。这主要归结于兽药抗生素具有防治动物疫病和促进生长的双重功效[6]。这些抗生素在一系列传递后最终排放到环境中，可引起致病菌获得抗生素耐药性等不利影响[7]。因此，在蜂王浆销售前，严格的抗生素检测措施是必不可少的，而如何方便、快速、精准的定性定量分析蜂王浆中的抗生素残留一直是该领域的研究重点。本文对蜂王浆中抗生素残留的几种主要检测方法进行了综述。

1 蜂王浆中的抗生素残留

20 世纪40 年代，青霉素的发现在第二次世界大战中大放异彩，它优异的抗菌消炎功效拯救了无数人的生命。而在随后的70 多年间，各种各样的抗生素类药物被广泛应用在医疗、兽医、养殖等领域。抗生素类蜂药一经问世便被诸多养蜂者视为“万能药”，相伴而生的便是盲目用药、过量用药、防病用药、生产期用药等一系列不科学用药，出现“药残”现象，严重影响蜂产品品质[8]。养蜂业常用的抗生素类药物主要有：青霉素、头孢菌素、林可霉素、四环素、链霉素、红霉素、替米考星、土霉素、金霉素、多西环素、喹诺酮类、卡那霉素、氯霉素、泰乐菌素、β-内酰胺等。如盐酸土霉素可用于治疗美洲幼虫腐臭病和欧洲幼虫腐臭病、使用制霉菌素治疗白垩病、烟曲霉素治疗孢子虫病等[9]。

2 检测方法

2.1 液相色谱法

液相色谱法是一种分析速度快、分离效能高、自动化的分析方法，具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点，是蜂王浆内抗生素残留的主要检测方法。装置由固定相和流动相组成，固定相置于色谱柱中，种类繁多，如吸附剂离子交换树脂等；流动相为各种溶剂。待测样随流动相进入色谱柱后，因各组分间对固定相的吸附能力、分配系数等因素的差异（因固定相种类而定） 使得各组分从色谱柱中流出时间不同，从而实现组分的分离。然后各组分进入检测器（紫外、荧光、示差折光检测器和质谱仪） 中进行定量分析。

物质均由一种或多种元素组成，而不同元素之间的差异便是核电荷数不同，因此两个不同元素的离子质量存在差异。质谱法是将样品电离转化为气态离子后根据其不同的质荷比大小分离并进行分析。质谱仪灵敏度高、结构分析性能强，除对待测样品进行独立定性或定量分析外，还可作为高效液相色谱的检测器使用，即高效液相色谱- 质谱法（HPLC-MS 或LC-MS）。

GB/T21164-2007[10]中规定了液相色谱法检测蜂王浆中链霉素、双清链霉素残留量的方法，该方法使用庚烷磺酸钠-磷酸钠混合液提取，C18 为固定相，甲醇为流动相，经荧光检测器检测，使用外标法定量。周碧青等[11]使用高效液相色谱法测定了蜂王浆中3 种四环类抗生素残留，该方法采用Na2EDTA-Mellvaine 缓冲液提取后经SPE 固相萃取纯化，使用紫外检测器进行测定。

而在国标法中，液相色谱法-串联质谱法得到了广泛应用。如GB/T 22945-2008[12]中使用该方法将链霉素、双氢链霉素和卡那霉素提取后经苯磺酸型和羟酸型固相萃取柱，串联质谱仪检测蜂王浆中三种抗生素残留。Zhang 等[13]使用pH 6.0 磷酸盐缓冲液提取,经HLB 小柱净化富集后,采用高效液相色谱- 串联质谱法对蜂王浆中红霉素及其代谢产物进行了分析。此外，林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素[14]（GB/T 22946-2008）、土霉素、四环素、金霉素、多西环素[15](GB/T 23409-2009)等抗生素均可采用液相色谱法-串联质谱法检测。

3.2 酶联免疫法

酶联免疫法是一种特殊的试剂分析方法，试剂主要包括固相的抗体或抗原、酶标记的抗体或抗原、显色剂三部分，因酶具有高的催化频率，该方法具有高的灵敏度。酶联免疫法使用酶分子标记抗体或抗原（保留抗体或抗原免疫学特性的同时又保留了酶的活性） 与固相的抗体或抗原特异性结合，通过显色液发生显色反应，根据溶液的颜色变化对待测样进行定性或定量分析。

邢淑婕[16]使用自制的土霉素酶联免疫检测试剂盒检测了蜂王浆中土霉素残留含量，发现所有样品中均有土霉素残留，残留量可达到农业农村部规定的限量标准；此外，平行使用的结果表明，酶联免疫法的灵敏度远高于TLC 法（薄层色谱法）。赵晖等[17]使用四环素酶联免疫检测盒测定了出口蜂产品中抗生素含量，结果表明当蜂蜜和蜂王浆中四环素浓度为0.025 mg/kg 时，10 次检测均为阳性，可满足对出口蜂王浆的检测要求（四环素含量<0.05 mg/kg），不存在漏选的现象。行业标准SN/T 2058-2008[18]、SN/T 2059-2008[19]和SN/T 2060-2008[20]中也规定了使用酶联免疫法检测蜂王浆中氯霉素、链霉素、双氢链霉素和泰乐菌素残留的所需仪器、试剂和操作规范等。

2.3 放射受体分析法

该方法与酶联免疫法类似，受体（具有特定氨基酸序列和构型的蛋白质） 可与使用放射性核素标记的配体发生特异性结合，通过非标记配体与标记配体对受体的竞争关系，根据已知的非标记配体浓度来推知待测样品浓度[21]。

SN/T 2664-2010[22]中采用放射受体分析法检测了蜂王浆中四环素类抗生素残留，标记配体为[3H]标记的金霉素，将提取出的四环素类抗生素稀释后与配体共同竞争结合特异的受体位点，经反应后加入闪烁剂测定β 粒子数放射性量值，计数cmp 值，该值与蜂王浆中四环素残留呈反比。

3 展望

简要综述了几种蜂王浆中抗生素残留的检测方法，其中高效液相色谱法在蜂王浆抗生素残留的检测中使用最为广泛，可检测绝大多数抗生素，精度高、出峰快。该方法的短板主要在于仪器的检测器，高效液相色谱的检测器大致可分为紫外检测器、荧光检测器、示差折光检测器和质谱仪几种，其中紫外、荧光检测器为选择型检测器，只对特定的待测样品响应，其他待测样无响应或响应过小，不具备普适性；而且示差折光检测器对样品浓度具有较高要求，不能使用梯度洗脱；相较而言，质谱仪更适合作为检测器使用（这也是绝大多数的检测方法或标准使用高效液相色谱-质谱法的原因），但其价格昂贵，售价都在几十万元至上百万元不等。目前关于酶联免疫法和放射受体分析法检测蜂王浆中抗生素残留的研究相对较少。尤其是放射受体分析法，在国内文献中，目前笔者仅找到了使用该方法检测四环素的相关文献。