尖孢镰刀菌效应蛋白研究进展

林羽立

(厦门市农业技术推广中心，福建 厦门 361000)

尖孢镰刀菌(Fusarium oxvsporum)是真菌类群，分类上隶属于半知菌类(Xmperfeetifungi)、镰刀菌属(Fusarium)。尖孢镰刀菌通过无性繁殖产生大量形似镰刀的大型分生孢子寄生在作物体内，并以土壤传播形式广泛存在于世界范围内。尖孢镰刀菌主要从根部危害植物，引起维管束发生，破坏导管功能，造成植物枯死，可危害植物的整个生育期。尖孢镰刀菌与农业生产息息相关，可导致多种农作物发生真菌性病害，如黄瓜、西瓜、哈密瓜、黄豆、辣椒、番茄、甘蔗、甘薯、大豆等，给农业生产带来了严重的损失[1]。目前，尖孢镰刀菌与农作物的互作关系已经成为国内外的研究热点，有助于明确病原菌的致病机理，以及为遗传育种、突变体资源和基因组信息方面提供更多便利。而效应蛋白是病原菌与植物互作过程中产生的分泌物，其与尖孢镰刀菌的致病性和寄主的抗病性有着密切关系。因此，病原菌效应蛋白的研究是了解尖孢镰刀菌和农作物互作关系的重要研究方向。近年来，针对尖孢镰刀菌效应蛋白的预测、功能鉴定及其作用机制等方面的研究已取得一定的成果。本文综述了尖孢镰刀菌效应蛋白的研究现状，包括分泌蛋白组、致病蛋白、无毒蛋白等方面，并对未来的研究方向做出探讨。

1956年，Flor在亚麻和亚麻锈菌的小种特异抗性的研究基础上提出“基因对基因”抗病性学说，该学说认为，当携带无毒基因(avirulence gene,Avr基因)的病原体侵染携带抗病基因(resistance gene,R基因)的寄主时，寄主会表现抗病。农作物与镰刀菌的互作关系符合这一学说[2]。随着植物分子病理学的发展，2006年Jones认为当病原菌侵染作物时，作物表面启动PAMPs(pathogen-associated molecular patterns)分子机制识别病原菌，由此激发作物的PTI(PAMP-triggered immunity)免疫反应，而病原菌会分泌一些蛋白到寄主细胞中抑制植物的免疫反应，此类蛋白被称为效应蛋白，此时寄主细胞内的R基因所编码的R蛋白会对病原菌的效应蛋白进行特异性识别，继而激发ETI(effector-triggered immunity)免疫反应，这是作物“基因对基因抗性”特异性防御系统，仅发生在特定寄主基因型与病原小种之间[3]。经过寄主和病原菌协同进化，新的效应蛋白和抗性蛋白不断产生。

1 镰刀菌分泌蛋白组

只有当病原效应蛋白到达作物寄主细胞的特定空间时，病原菌的功能才能发挥。真菌病原菌的效应蛋白因子在细胞内合成后，由信号肽引导通过内质网-高尔基体-质膜的分泌途径分泌到胞外[4]。真菌分泌蛋白的的信号肽位于蛋白序列的N-末端，约由15～60个疏水氨基酸残基组成。分泌蛋白包括细胞外基质蛋白、生长因子和细胞因子等，占基因组编码的所有蛋白质中的10%～15%[5]。

近年来，植物真菌全基因组序列的解析为植物病原的分泌蛋白组提供了重要的研究基础。禾谷类镰刀菌(F.graminearum)是第1个完成全基因组测序的镰刀菌[6]，2005年DOE JGI启动了腐皮孢镰刀菌(F.solani)基因组测序计划，2008年Broad研究所完成拟轮枝镰刀菌(F.verticillioides)和尖孢镰刀菌(F.oxysPorum)基因组测序。2007年Cuomo c A等利用近亲缘杂交技术分析了禾谷镰刀菌侵染植物过程中的单核苷酸多态性(SNPs)，结果在高密度SNPs区域中检测到382个高效特异表达的基因，其中包括分泌蛋白和毒力因子，分泌蛋白的N端具有一段引导多肽进入内质网的疏水信号肽，该信号肽在基因序列上具有相应的编码，因此可以通过序列比对和信号肽预测来寻找分泌蛋白[7]。2007年Paper等以禾谷镰刀菌为研究对象，对体外培养和感染小麦时的分泌蛋白组进行分析，推测信号肽在禾谷镰刀菌与宿主作物相互作用中发挥了重要作用[8]。于钦亮等基于生物信息学的方法对禾谷镰刀菌全基因组进行信号肽分析，预测出606个潜在的分泌蛋白编码基因，继而在潜在分泌蛋白中发现157个分泌蛋白带有保守的RXLX模体，其中有79个分泌蛋白具有可预测的功能性描述，形成了该物种的激发子蛋白集[9]。2010年Ma L J等以镰刀菌属中3个不同寄主范围的生理小种为研究对象，对其分泌蛋白组进行差异比较，发现了强毒菌株特有的4条LS染色体可将弱毒株转化为强毒株，LS染色体中含有大量的激发子类和细胞壁降解酶类分泌蛋白基因，从而证明分泌蛋白类群在镰刀菌生物学毒性中起重要作用[10]。2012年Brown等在禾谷镰刀菌上确定了2007个决定植物致病和毒性的外分泌蛋白[11]。镰刀菌的分子生物学研究起步较晚，目前仅局限于对单个致病基因功能的研究水平，而部分镰刀菌菌种基因组测序的完成会为基因组学、蛋白质组学全面分析菌种致病性、效应因子等相关研究带来契机。

2 影响致病性的镰刀菌分泌蛋白

镰刀菌在孢子萌发后形成菌丝体，可侵染作物根尖或新鲜伤口组织，在寄主体内繁殖并产生大量的致病性相关分泌物。尖孢镰刀菌番茄专化型(F.oxysporum f.sp.lycopersici,Fol)是一种胞外病原菌，在侵染番茄木质部时会产生分泌蛋白在木质部的汁液中，即Six蛋白(Secreted In Xylem)[12]。现已在Fol中发现了14种Six基因，即Six1～Six14[13-15]。最初，研究者认为Six基因仅存在于Fol中，如今也发现存在于其它尖孢镰刀菌专化型中[16]。目前，Six蛋白的致病性研究已经取得了很大进展。尖孢镰刀菌可侵染100多种植物，但每个专化型只能侵染一种或少数几种作物，寄主范围窄，特异性强，这与Six蛋白的功能密切相关。

研究表明，Six基因与病菌的致病力密切相关。Fov侵染寄主时，Six基因可作为分子标记来识别病原菌的存在。以Six6为例，通过PCR分子标记技术，可以将具有致病性的Fov菌种与其它非致病性的菌种区分开来，即含有Six6的菌种为Fov[17]。同时，Six6是致病因子，其能够增加镰刀菌的致病性[18]。所有Six6均具有8个保守的半胱氨酸残基，其中1个位于信号肽中，且不同生理小种的Six6蛋白存在若干氨基酸的差异，这些差异会造成Six6氨基酸涉及到的致病因子功能的不同[19]。此外，镰刀菌分泌的Six6蛋白还能激发寄主植物的抗性机制，2012年牛晓伟从Fon中克隆了Six6基因，通过构建该基因的酵母诱饵表达载体并采用酵母双杂交技术，明确了FonSIX6主要作用的靶位点可能主要是植物能量系统和光合作用，而植物识别后对其响应的方式是调控抗病基因的表达，为西瓜的抗病机制提供了线索[20]。镰刀菌中Six6基因的存在虽然对植物生长发育有着重要影响，却不影响真菌自身的生长。2013年唐安宁在克隆了Fon的Six6基因后，利用基因敲除技术构建了FonSIX6基因缺失突变体，观察后发现，该基因的缺失并不影响真菌的生长情况。这主要原因可能是FonSIX6蛋白含有16个氨基酸的信号肽，属于分泌型蛋白，并不参与生理小种的生长过程[21]。

3 诱导植物细胞坏死的镰刀菌效应蛋白

一些植物病原菌在侵染寄主的过程中分泌的蛋白质可诱导植物细胞的死亡，即效应蛋白可作为毒性因子来发挥作用。

NIP蛋白(necrosis inducing protein)是一种细胞凋亡诱导蛋白，可诱导植物细胞死亡，引发植物抗性相关基因的表达。2011年据Feng报道，在植物病原真菌中存在NIP蛋白家族[22]，不同的NIP基因可能在不同的时期表达，执行不同的功能。2012年Kirsten发现，大麦云纹菌中NIP1基因在孢子世代就已表达，其与孢子生长有关，而NIP2和NIP3仅在侵染过程中表达，与致病过程密切相关[23]。但在不同寄主植物中，NIP蛋白的致病性可能存在着差异，2013年Santhanam发现，维管枯萎病原菌中存在2个可诱导作物细胞死亡的NIP蛋白，但对拟南芥、烟草和番茄无致死功能[24]。2014年Feng发现，辣椒疫霉菌中存在3个NIP基因存在很强的致病性，并且在辣椒中诱导叶片失绿和细胞凋亡的效果比在烟草中强烈[25]。

有些NIP蛋白中还可诱导植物产生乙烯并致其死亡，即为NLP蛋白(NEP1-like proteins)，其具有半保守结构域和N-末端分泌信号肽的蛋白质，是一类新型的诱导坏死效应蛋白。1995年Bailey等从尖孢镰刀菌培养液中分离出NLP蛋白(NEP1-like proteins)，可诱导作物产生乙烯并致其死亡，是一类新型诱导作物坏死的效应蛋白[26]，随后研究者发现，这类蛋白质广泛存在于农作物病原细菌、真菌、卵菌以及一些非病原微生物中，其中以卵菌居多，如腐霉菌、疫霉菌、大豆疫霉菌以及细菌软腐病菌等[27]。NLP蛋白既能激发植物的抗病反应，又能诱导植物细胞死亡，目前已证实20多种双子叶植物中的NLP蛋白有上述作用[28]。基于NLPs蛋白的研究表明，诱导植物细胞坏死的蛋白对病原菌的致病力和毒性有着重要的影响，因为其在病原侵染寄主的过程中存在着高表达。2006年Kanneganti等在致病疫霉3个NLP基因中发现PiNPP1.1基因具有很强的诱导细胞死亡的活性[29]。Qutob和Kanneganti的研究表明，在大豆疫霉病和马铃薯晚疫病中，NPP1和PiNPP1.1在后期的腐生阶段及侵染过程中呈上调表达，由此推测NLPs通过溶解细胞实现病原菌的致病性[29]。2009年Ottmann等验证了这一推测，通过解析NLPs的晶体结构，发现NLPs具有细胞溶解毒素功能，病原菌通过分泌这一毒素，破坏寄主细胞膜完整性并促使植物细胞产生坏死[30]。但并不是所有NLP蛋白都具有细胞溶解活性，且致病效果也不尽相同。2013年Parthasarathy等论证了NLP蛋白家族的功能多样性，在NLP1～NLP7和NLP9中，只有NLP1和NLP2对番茄有毒性作用，可影响植物的营养生长和孢子的萌发，其余的NLP蛋白对番茄不具有致病性[31]。因此，NLP蛋白在不同病原菌和植物寄主之间发挥着不同的作用。

4 镰刀菌Avr蛋白

根据Flor提出的“基因对基因”抗病性学说，只有当病原携带Avr基因且寄主携带R基因时，二者互作才表现出不亲和，即寄主表现抗病[2]。农作物与镰刀菌的相互作用符合这一学说，并已经成为植物病理学的研究热点。目前，虽然只在少数真菌中成功克隆到无毒基因，但相关研究也取得了一定进展。

尖孢镰刀菌的Six蛋白在其与番茄的互作中起着重要作用，其中Six1、Six3、Six4已被鉴定为无毒蛋白，分别命名为Avr3、Avr2、Avr1[13]。Avr3是一种小分子量富含半胱氨酸蛋白，属于非原质体蛋白，大小约32kDa，在番茄抗病蛋白I-3、I-2和I介导的抗病过程起重要作用[18]。Fol侵入番茄之后，在木质部中分泌Avr3蛋白，诱导番茄寄主的I-3抗性基因的大量表达，从而启动防御机制，可提高番茄的抗病。当Fol缺失Avr3时，病原菌可能将对番茄产生致病性。因此，Fol中的Avr3可作为无毒因子触发番茄抗性，其的缺失很可能会导致番茄病变[32]。编码Avr3的基因位于Fol基因组的一条非必要小染色体上，这条染色体含有许多转座因子和类似致病岛的区域，在其它真菌病原真菌中也有相同描述，如交链孢属、丛赤壳属等。

Six4蛋白由无毒基因Avr1编码，是1个小分子量富胱氨酸分泌蛋白，与Avr3、Six和Avr2不在同一条染色体上，携带Avr1的Fol菌株可以诱导番茄产生I或I-1基因介导抗病过程。然而，不同于Fol中的Avr3和Avr2，Avr1在不具有特异R基因的番茄生理小种中是不致病的，即Avr1是无毒因子。并且，Fol的Avr1会抑制番茄的I-2和I-3基因所诱导的抗性反应，但是这种抑制功能的潜在分子机制还未定论[33]。农作物是否具有相应R基因决定其对某种病原物的特异抗性，同时，病原物是否具有Avr基因决定其的专一致病性[34]。因此，Avr基因是理想的分子标记候选，其可以通过自身的专一致病性将菌种区分开[34]。据Lievens等和Van der Does等的报道，在Fol的生理小种Ⅰ中有Avr1基因，而生理小种Ⅱ和生理小种Ⅲ中找不到Avr1基因，因此，Avr1基因可区别生理小种Ⅰ和生理小种Ⅱ、Ⅲ。另外，可利用Avr2基因将生理小种Ⅱ、Ⅲ与其它菌种区分[33]。

5 展望

效应蛋白在植物与尖孢镰刀菌互作过程中起着关键作用，其既关系着植物病原菌能否成功侵染寄主，也是植物免疫系统识别病原菌的靶标。明确效应蛋白的功能及其作用机制是植物病理学的研究重点，对农业生产有着深远意义。

目前，植物与尖孢镰刀菌的互作机制研究已经取得了一定的进展，如部分尖孢镰刀菌基因组测序的完成、致病或致死相关基因的分离与功能鉴定、无毒蛋白的发现和功能鉴定等。但此研究仍然处于起步阶段，甚至相较于其它病原真菌的研究仍显滞后，尖孢镰刀菌的基因组测序工程仅局限于若干生理小种，导致仍有许多生理小种的效应蛋白研究仍是空白；已完成基因组测序的镰刀菌中存在的编码分泌蛋白数量仍在预测阶段，绝大多数基因功能属于未知阶段；镰刀菌效应蛋白致病性的分子机制仍未见报道；镰刀菌效应蛋白作用与寄主细胞的靶标及功能机制还有待阐明等。因此，将分泌组学、比较基因组学和比较蛋白质组学相结合来鉴定效应蛋白是研究农作物与尖孢镰刀菌互作机制的主要研究方向。