L-精氨酸诱导小鼠急性胰腺炎的给药剂量及造模时间

王鑫鑫 ， 陈梓璐 ， 尹 星 ， 刘 璐 ， 崔博凡 ， 张 鹏,2

(1. 沈阳工学院生命工程学院 ， 辽宁 抚顺 113122 ; 2. 俄罗斯滨海国立农学院 ， 俄罗斯 乌苏里斯克市 692500)

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是胰酶激活后引起胰腺组织自身消化所致的急性炎症介质反应，可诱发全身炎性介质反应，并恶化为多器官衰竭甚至死亡[1]。在AP中，通过测定血清淀粉酶活性进行临床诊断[2]，原因是血清淀粉酶主要来源是胰腺，当胰腺出现炎性反应时，胰蛋白酶分泌过度旺盛，引起血清淀粉酶含量升高。目前，AP在犬、猫中发病率非常高[3]，但临床对于其发病原因及其发病机制知之甚少，迫切需要建立一种理想的AP动物模型供其相关研究。近年来，AP造模方法有许多种，普遍采用腹腔注射L-精氨酸的方法进行诱导，但国内外对L-精氨酸的注射剂量、给药次数以及造模时间略有差别。因此，本试验在前人基础上进行改进，全面系统地比较不同时间、不同剂量L-精氨酸最佳的造模条件，以期为临床研究和治疗AP提供稳定的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性昆明小鼠54只，体重18～22 g，SPF级，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号为SCXK(辽)2015—0001。

1.2 试验分组与设计 试验前禁食12 h，自由饮水。将小鼠随机分成9组，每组6只，分别为对照组、不同时间组和不同剂量组。不同剂量组每组注射剂量分别为2、4、6 g/(kg·bw)和8 g/(kg·bw) 的20%L-精氨酸，分3次注射，每次间隔20 min，同时对照组注射等体积0.9%NaCl。不同时间组分别于注射后6、12、24 h和48 h进行取样。收集血液，一部分用于血常规检查；剩余部分离心制备血清用于血清淀粉酶活性的测定；分离各组小鼠的胰腺组织，用于制备病理组织切片。

1.3 试验材料 L-精氨酸，购自大连美仑生物技术有限公司，使用时用0.9%生理盐水配制成20% L-精 氨酸溶液，pH为7；血清淀粉酶检测试剂盒和苏木精-伊红染色剂等其他试剂，均购自南京建成生物科技有限公司。

1.4 血清样本制备 将采集到的全血置于1.5 mL离心管中，低温4 ℃ 1 000 r/min离心10 min，移出上层血清置于-20 ℃冰箱中保存。

1.5 观察指标

1.5.1 白细胞数量的测定 采用干式血细胞分析仪进行测定，记录试验数据。

1.5.2 组织病理学检查 取胰腺组织样本后放置在10%甲醛溶液中浸泡48 h，用来制成石蜡切片，置于光镜下观察其病理变化。

1.5.3 血清淀粉酶活性测定 采取碘-淀粉比色法测定血清淀粉酶活性，按照试剂盒说明书进行操作，记录试验数据。

1.6 数据统计与分析 所有数据需要进行统计学分析，使用SPSS Statistics 17.0软件对数据进行一维方差分析，经过分析之后的各组试验数据结果均列入三线表中。

2 结果

2.1 小鼠状态观察 本试验不同时间组和不同剂量组小鼠均出现不同程度的临床症状，其中造模6 h、12 h、2 g/(kg·bw)、4 g/(kg·bw)组和6 g/(kg·bw)组小鼠均出现精神沉郁、聚集成堆，个别小鼠呼吸加深、加快等临床症状。8 g/(kg·bw)组小鼠表现为体温下降，团缩一起，饮食废绝，且该组小鼠注射2 h内均死亡，死亡率为100%。

2.2 白细胞数量测定 与对照组进行对比，时间组和剂量组小鼠的白细胞数量都有明显的上升，其中6 h、12 h组和24 h组小鼠的白细胞数量极显著上升(P<0.01)，48 h组小鼠白细胞数量显著上升(P<0.05)， 见表1；剂量组小鼠的白细胞数量均极显著升高(P<0.01)，见表2。

表1 小鼠急性胰腺炎造模时间筛选的白细胞数量检测结果Table 1 Detection results of WBC count in mice with acute pancreatitis by modeling time screening

表2 小鼠急性胰腺炎造模剂量筛选的白细胞数量检测结果Table 2 Detection results of WBC count in mice with acute pancreatitis by modeling dose screening

2.3 血清淀粉酶活性测定 与对照组进行对比，时间组和剂量组小鼠的血清淀粉酶活性均极显著上升(P<0.01)，见表3、4。试验结果表明，试验小鼠已经发病，需要进一步观察胰腺组织的病理变化，综合判断小鼠的急性胰腺炎的病情状况。

表3 小鼠急性胰腺炎造模时间筛选的血清淀粉酶活性的检测结果Table 3 Detection results of serum amylase activity in mouse with acute pancreatitis by modelling time screening

表4 小鼠急性胰腺炎造模剂量筛选的血清淀粉酶活性的检测结果Table 4 Detection results of serum amylase activity in mouse with acute pancreatitis by modeling dose screening

2.4 胰腺组织病理形态学检查 病理切片结果图1，按炎症分级情况进行病理学评定：对照组小鼠的胰腺组织纹理清楚，腺泡细胞形态正常，未见炎性细胞浸润、水肿、充血和组织坏死(图1A)；剂量组和时间组小鼠胰腺组织都出现不同程度的组织崩解，腺泡细胞坏死，胰腺导管增生及扩张，局部有充血并伴有大量淋巴细胞、单核细胞浸润(图1B～1H)，尤其以6 h组和12 h组最为严重(图1B、图1C)，24 h组胰腺组织病变程度降低(图1D)；2 g/(kg·bw)剂量组胰腺实质改变，可见少量的点状出血点和水肿(图1F)；4 g/(kg·bw)和6 g/(kg·bw)剂量组胰腺组织炎症较明显(图1G、1H)。

图1 小鼠胰腺组织病理形态学检查结果 (200×)Fig.1 Results of histopathological examination of mouse pancreas (200 ×)A：对照组; B：造模时间6 h组; C：造模时间12 h组; D：造模时间24 h组; E：造模时间48 h组; F：造模剂量2 g/(kg·bw)组; G：造模剂量4 g/(kg·bw)组; H：造模剂量6 g/(kg·bw)组A：Control group; B：Modeling time 6 h group; C：Modeling time 12 h group; D：Modeling time 24 h group; E：Modeling time 48 h group; F：Modeling dose 2 g/(kg·bw) group; G：Modeling dose 4 g/(kg·bw) group; H：Modeling dose 6 g/(kg·bw) group

3 讨论

急性胰腺炎是临床常见疾病，据调查发现，临床犬猫胰腺炎发病率逐年升高，且具有较高死亡率。因此，为了更好的了解AP发病机制，建立稳定的动物模型至关重要，而且可以为相关药物的研发提供前期保障。小鼠急性胰腺炎模型建立方法有很多，20%L-精氨酸溶液为常见诱导药物之一，其具有操作简单、重复性高、对模型动物应激较小等优点，并且有学者通过比较牛黄胆酸钠、雨蛙肽、L-精氨酸诱导AP效果时发现，L-精氨酸诱导AP动物模型更具有重复性[4-5]。通过前期预试验发现，配成pH=7、浓度为20%L-精氨酸溶液诱导急性胰腺炎小鼠的存活率较高，因此本试验采用20%L-精氨酸溶液作为诱导药物。据国内外相关报道发现，大部分学者就给药剂量或时间进行单方面考查AP模型[6-9]，本试验不仅对诱导药物进行比较，而且从给药时间和给药剂量两方面同时衡量模型稳定性，更加符合AP模型建立的实际情况。除此以外，本试验还改良了给药次数，大部分报道为20%L-精氨酸分2次注射到小鼠腹腔中，注射间隔为1 h[10-11]，本试验发现同样剂量下分3次给药，每次间隔20 min，试验小鼠不仅存活率较高，而且模型更加稳定。据此通过本试验发现，6 h、12 h、24 h、2 g/(kg·bw)、4 g/(kg·bw) 和6 g/(kg·bw)各组小鼠的检测指标虽与对照组对比均极显著上升(P<0.01)，但造模时间为6 h、给药剂量为4 g/(kg·bw)时，各项指标达到峰值且稳定，小鼠存活率也较高。因此，当20%L-精氨酸剂量为4 g/(kg·bw)、造模时间为6 h时， 视为最佳造模条件。