海南省猪蓝耳病血清学监测

彭维祺 孙卫平 叶丹 荣光

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 海南海口 571101)

猪蓝耳病是猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）的俗称，该病是由PRRS 病毒（PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，以母猪流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及各种年龄猪特别是仔猪呼吸道疾病为主要特征［1-2］。1987 年，美国首次报道PRRS，现已遍布世界各地。1996 年，中国首次报道由PRRSV 美洲经典株所致的PRRS［1］；2006年，由PRRSV 美洲型变异株所致的高致病性PRRS（HP-PRRS）在中国爆发［3］，并迅速蔓延全国，成为危害中国养猪业最严重的的疫病，控制该病对于保障养猪生产稳定发展意义重大［4］。经过多年努力，猪蓝耳病呈平稳态势，以散发性临床疫情为主，无严重疫情发生［3］。近年来，由于毒株变异，猪蓝耳病毒减毒活疫苗使用效果不够理想，存在散毒风险等，有不少养殖企业停止了减毒活疫苗使用，特别是种猪养殖企业，通过实施闭群饲养和自繁自养、检测淘汰阳性个体等策略，病毒感染率呈下降态势，取得了比较理想的防控效果［5］。通过抗体监测可正确评估猪场PRRSV的免疫效果和野毒感染情况［6］。酶联免疫吸附试验（ELISA）具有操作简单、高通量、快速高效等优点，是农业农村部规定的抗体检测方法［7］。本研究在海南省18 个不同类型猪场采集血液样品333份，采用ELISA 对血清PRRSV 抗体进行了检测和分析，并提出合理化建议，为海南省猪蓝耳病有效防控提供科学依据，对海南省无规定疫病示范区和自由贸易港建设均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

猪繁殖与呼吸综合征抗体试剂盒（间接ELISA），批号为2020101402，购自深圳真瑞生物科技有限公司。

1.1.2 仪器设备

酶标仪、微量移液器、恒温培养箱、微量振荡器。

1.2 方法

1.2.1 样品采集及制备

1.2.1.1 样品采集

于2020 年12 月在海南省18 个养殖场（户），采集猪前腔静脉血10 mL 置于真空采血管中，采集血样共计333 份。其中规模免疫场3 个，采集血样50 份；未免疫规模场11 个，采集血样210 份；未免疫散养户4个，采集血样73份。

1.2.1.2 血清制备

室温静置15 min，待血清析出后，以4℃、2 500 r/min 离心15 min，将上层血清转移至灭菌的1.5 mL离心管中，-20℃保存，备用［8］。

1.2.2 样品检测

（1）取包被板，吸取稀释好待检血清100 µL加入到检测板中；同时设置阴性对照1孔、阳性对照2孔，取阴性及阳性对照各100µL分别加入反应孔中，轻轻振匀孔中样品（勿溢出）。（2）盖上封板膜，置37℃温育30 min。（3）小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，每孔加250 µL 工作浓度洗涤液后甩去孔内液体，重复4～6 次，最后在干净吸水纸上拍干。（4）每孔加酶结合物100 µL，盖上封板膜，置于37℃温育30 min。（5）小心揭开封板膜，甩掉板孔中的溶液，洗涤4～6 次，方法同（3）。切记最后在干净吸水纸上拍干。（6）每孔各加入显色液100 µL，轻微震荡混匀、盖上封板膜于37℃闭光显色10 min。（7）每孔加入50µL 终止液，使反应终止，10 min 内用酶标仪于450 nm（630 nm作参比波长）读取吸光度OD值。

结果判定：试验OD阴性对照＜0.2，同时OD阳性对照＞0.5， 试 验 成 立 。 判 定 标 准 ：（OD样品－OD阴性对照） ÷ （OD阳性对照－OD阴性对照） ＝IRPC。IRPC≥0.4则判为阳性，否则判为阴性。

2 结果与分析

2.1 总体血清抗体检测结果

18个养殖场（户）333份猪血清抗体检测结果见表1。其中免疫规模场、未免疫规模场、未免疫散养户血清抗体阳性率分别为68%、0、12%。

表1 血清抗体检测结果

2.2 免疫规模场血清抗体检测结果

3 个免疫规模场血清抗体阳性率分别为100%、45%、50%，除A 场达到理想保护以外，其余2 场均未达到理想保护（表2）。

表2 免疫规模场血清抗体检测结果

2.3 未免疫养殖场血清抗体检测结果

2.3.1 未免疫规模场血清抗体

11个未免疫规模场血清抗体阳性率均为0（表3），净化效果均比较理想。

表3 未免疫规模场血清抗体检测结果

2.3.2 未免疫散养户血清抗体

4 个未免疫散养户血清抗体阳性率分别为10%、5%、31%、10%，抗体总阳性率为12%（表4），存在一定的野毒感染风险。

表4 未免疫散养户血清抗体检测结果

3 讨论与结论

3.1 讨论

从检测结果可以看出，3 个免疫规模场血清抗体阳性率分别为100%、45%、50%，抗体总阳性率为68%，按照蓝耳病抗体水平阳性率大于80%为全体免疫合格［9］，仅有1个场达到理想保护状态，其余2场均未达到理想保护。可能是由于：（1）免疫接种不规范，比如免疫程序不合理、疫苗注射部位或注射方式不科学、注射剂量不准等；（2）疫苗质量存在问题，例如疫苗存贮、运输条件不合理、操作不规范、疫苗污染等情况；（3）饲养管理不当，猪生长环境差、饲料和饮水不洁净等；（4）其他免疫抑制病的存在，猪如果感染了猪瘟、猪圆环病毒病等免疫抑制类疾病，在注射疫苗后，猪体不产生免疫应答，造成免疫失败［10］。因本研究所用的抗体检测试剂盒暂不能区分所检测抗体为感染抗体还是免疫抗体，散养户血清抗体阳性可能为野毒感染，也可能是母源抗体、购入已免疫仔猪等多种因素引起的［11］。未免疫规模场血清抗体阳性率均为0，提示未免疫规模场通过生物安全防控和检测净化可以达到理想效果。

动物疫病净化是一项复杂的工作，需要合理制定区域净化方案，构建严密的检测系统及严格的监督系统［12］。目前PRRS 已经退出了国家强制免疫计划，但按照农业农村部 《2020 年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》要求，应每半年开展一次病原学和血清学监测，对疑似患PRRS 猪的肺和流产胎儿胎衣进行病毒RNA 的提取，通过RTPCR 扩增，选取阳性PCR 产物并进行克隆、测序，与PRRSV代表毒株的序列进行比较［13-14］，对未免疫猪场抗体阳性猪和免疫猪场病原鉴定阳性猪均应进行淘汰，同时制定科学、合理的监测计划，按照完善的疫病净化方案，并不断对阳性猪只进行排查、淘汰，以期达到有效控制和逐步净化疫病的目的［15］。

3.2 结论

本研究采用间接ELISA 法对海南省18 个养殖场（户）猪蓝耳病抗体进行血清学监测发现，由于多方面原因，免疫规模场免疫效果不理想，未免疫规模场通过生物安全防控和检测净化免疫效果较好，未免疫散养户存在野毒感染的风险，为猪蓝耳病疫病的科学防控提供了参考依据。