黄淮麦区(南片)小麦新品系脂肪氧化酶活性分析及其等位基因检测

陈 杰，张星宇，张福彦，白 冬，宋佳静，宋全昊，金 艳，赵立尚，朱统泉，王 勇，梁宝萍，李 艳，宋晓朋

(1.河南省驻马店市农业科学院，河南驻马店 463000； 2.河南农业大学农学院，河南郑州 450002；3.河南省科学院同位素研究所有限责任公司/河南省核农学重点实验室，河南郑州 450015)

面粉色泽是评价小麦加工品质的重要指标之一，随着过氧化苯甲酰等面粉增白剂的禁用，选育自然白的小麦品种成为当务之急。面粉色泽不仅受到类胡萝卜素、黄色素等色素类物质的影响，同时还受到多酚氧化酶、过氧化物酶等酶类物质的影响。Loiseau等[1]和Dong等[2]研究表明，小麦籽粒中脂肪氧化酶(lipoxygenase，Lox)可氧化降解类胡萝卜素进而使面粉增白，因此，研究小麦籽粒中的Lox对改良小麦面粉色泽具有重要意义。

环境和基因型都能够影响Lox的活性，但基因型对Lox活性的影响较大[3-4]。小麦籽粒Lox活性是受多基因调控的数量性状。前人通过定位发现，小麦1A、4B、5D和7B 染色体上均存在影响Lox活性的基因位点，并发现了与其紧密连锁的SSR标记(Xwmc312、Xbcd1262、Xgwm251和Xksud2a)[5-7]。研究表明，小麦4B染色体上的基因位点对小麦籽粒Lox活性的影响较大[5-9]。近年来，随着小麦生物信息学的发展和同源克隆技术的应用，普通小麦Lox活性基因的克隆以及功能标记的开发也取得了快速的发展。Geng等[8]利用同源克隆的方法克隆了4B染色体上的TaLox-B1基因， 并根据等位变异序列之间的差异，开发设计了两对共显性互补功能标记Lox16和Lox18，用来检测TaLox-B1位点上的等位基因TaLox-B1a和TaLox-B1b。标记Lox16和Lox18已经在新疆、陕西、黑龙江和宁夏小麦材料检测中得到了应用[10-13]。随后，Zhang等[9]利用同源克隆的方法克隆了4B染色体上的TaLox-B2和TaLox-B3基因， 并根据等位变异序列之间的差异，开发设计了一对共显性功能标记Lox-B23，用来检测TaLox-B2和TaLox-B3位点上的等位基因TaLox-B2a、TaLox-B2b和TaLox-B3a、TaLox-B3b。标记Lox-B23已经在河南和新疆小麦材料检测中得到了应用[14-15]。

黄淮麦区(南片)小麦生产在保障我国粮食安全中发挥着重要作用，该区小麦产量、抗性、面筋品质等相关性状的遗传改良已经有了很大进步，但有关小麦籽粒Lox活性的改良尚显不足。本研究以94份黄淮麦区(南片)小麦新品系为材料，利用功能标记Lox16、Lox18和Lox-B23对其TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位点上的等位基因进行检测，同时利用分光光度计对供试材料的Lox活性进行测定，分析TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位点上等位基因的分布情况以及不同等位基因和Lox活性之间的关系，以期为小麦Lox活性分子标记的辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为2020-2021年度黄淮冬麦区南片水地组区域试验的小麦新品系，剔除组别间重复的对照品种，合计94份(表1)。其中来源于河南、安徽、陕西、江苏和北京的材料分别有52、16、12、10和4份。这些材料都是在黄淮麦区(南片)23个试验点经过两年品种比较试验晋级上来的材料，可以很客观地反映本麦区当前的小麦育种水平。

(续表1 Continued table 1)

1.2 脂肪氧化酶(Lox)活性的测定

利用UV-2601型分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司生产)测定供试材料的Lox活性，具体步骤参照吴培培等[4]的方法。

1.3 等位基因的分子检测

参照陈 杰等[16]的方法提取参试材料的基因组DNA。用Lox16和Lox18标记检测参试材料TaLox-B2位点的等位基因，扩增出489 bp 条带的材料记为TaLox-B1a类型，扩增出791 bp条带的材料记为TaLox-B1b类型；用 Lox-B23标记检测参试材料TaLox-B2和TaLox-B3位点的等位基因，扩增出788 bp 条带的材料记为TaLox-B2a类型，扩增出660 bp条带的材料记为TaLox-B2b类型，扩增出677 bp 条带的材料记为TaLox-B3a类型， 未扩增出任何带型的记为TaLox-B3b类型。所用标记的引物序列及退火温度等信息见表2。

表2 Lox不同位点等位基因检测引物信息Table 2 Primers for identification of different Lox alleles

PCR反应体系和扩增程序参照陈 杰等[16]的方法。标记Lox16和Lox18的PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳分离，标记Lox-B23的PCR扩增产物用3%的琼脂糖凝胶电泳分离，电泳缓冲体系为1×TBE Buffer溶液，电压设置为160 V，电泳时间为40 min，电泳结束后用0.5%的溴化乙锭(EB)染色，用凝胶成像系统 (Protein Simple，美国)查看PCR扩增带型，并拍照保存。

1.4 数据分析

用Microsoft Excel 2003进行数据分析，用SPSS 18.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 供试材料籽粒Lox活性的分布

对94份供试材料的Lox活性进行测定，结果(表1)表明，供试材料Lox活性的总体平均值为71.47 AU·min-1·g-1，标准差为5.49，变幅为59.8～83.1 AU·min-1·g-1。Lox活性低于70 AU·min-1·g-1的材料有38 份，占比40.4%；Lox活性在70～75 AU·min-1·g-1的材料有29份，占比30.9%；Lox活性值高于75 AU·min-1·g-1的材料有27份，占比 28.7%。其中，有6份材料(冠麦12、漯麦66、淮麦40、泉麦39、周麦36号和周麦49号)的Lox活性高于80 AU·min-1·g-1。有12份材料(西农172、涡麦179、许科10号、郑麦20、徐麦15019、新农9799、科麦1609、安科1704、丰工40、丰工38、淮麦701和平安918)的Lox活性低于65 AU·min-1·g-1。说明黄淮麦区(南片)大部分新育成小麦材料均以中等Lox活性为主。

2.2 TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位点等位基因的分布及其与Lox活性的关系

用标记Lox-16和Lox-18对供试材料的TaLox-B1位点进行等位基因检测，部分材料的检测结果如图1所示。94份供试材料中，淮核16174、瑞华麦519、漯麦68等17份材料可以扩增出489 bp的条带，说明这些材料含有TaLox-B1a等位基因，分布频率为18.1%；淮核16132、华麦15080、保丰1707等77份材料可以扩增出791 bp的条带，说明这些材料含有TaLox-B1b等位基因，分布频率为 81.9%。从以上检测结果分析可知，94份供试材料的TaLox-B1位点以TaLox-B1b等位基因类型分布为主。

a：Lox-16标记的扩增结果；b：Lox-18标记的扩增结果；M：Marker；1：淮核16132；2：华麦15080；3：保丰1707；4：淮麦701；5：瑞华556；6：保麦1633；7：淮核16174；8：徐麦15019；9：瑞华麦519；10：淮麦40；11：漯麦68；12：驻麦586。图2同。a:Amplification result by Lox-16; b:Amplification result by Lox-18; M:Marker; 1:Huaihe 16132; 2:Huamai 15080:3:Baofeng 1707; 4:Huaimai 701; 5:Ruihua 556; 6:Baomai 1633; 7:Huaihe 16174; 8:Xumai 15019; 9:Ruihuamai 519; 10:Huaimai 40; 11:Luomai 68; 12:Zhumai 586. The same in figure 2.图1 Lox-16和Lox-18标记对部分供试小麦品种TaLox-B1位点的扩增结果Fig.1 Amplification results of TaLox-B1 by markers Lox 16 and Lox 18 in some wheat cultivars

用标记Lox-B23对供试材料的TaLox-B2和TaLox-B3位点进行等位基因检测，部分材料的检测结果如图2所示。在TaLox-B2位点，淮核16132、华麦15080、保丰1707等83份材料可以扩增出788 bp的条带，说明这些材料含有TaLox-B2a等位基因，分布频率为88.3%；徐麦15019、涡麦179、许科10号等11份材料可以扩增出660 bp的条带，说明这些材料含有TaLox-B2b等位基因，分布频率为11.7%；在TaLox-B3位点，华麦15080、保丰1707、瑞华556等63份材料可以扩增出677 bp的条带，说明这些材料含有TaLox-B3a等位基因，分布频率为67.0%；淮核16132、淮麦701、淮核16174等31份材料未扩增出任何条带，说明这些材料含有TaLox-B3b等位基因，分布频率为33.0%。从以上检测结果分析可知，94份供试材料的TaLox-B2和TaLox-B3位点分别以TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因类型分布为主。

图2 Lox-B23标记对部分供试小麦品种TaLox-B2和TaLox-B3位点的扩增结果Fig.2 Amplification results of TaLox-B2 and TaLox-B3 by marker Lox-B23 in some wheat cultivars

从表3可以看出，在TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位点，分别检测到两种等位基因，且两种等位基因之间的Lox活性差异均达到显著水平，TaLox-B1a、TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因与高Lox活性相关，TaLox-B1b、TaLox-B2b和TaLox-B3b等位基因与低Lox活性相关。

表3 不同位点等位基因对Lox活性的影响Table 3 The effect of different alleles on Lox activity

2.3 不同等位基因组合的分布及其与Lox活性的关系

94份供试材料中，TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位点共检测到六种类型的等位基因组合(表4)。其中含有TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因组合的材料最多，有53份，分布频率为56.4%；含有TaLox-B1a/TaLox-B2b/TaLox-B3b等位基因组合的材料最少，仅有2份，分布频率为2.1%；其余四种类型等位基因组合的分布频率由高到低依次为TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b、TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b和TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3b，分布频率分别为16.0%、10.6%、9.6%和 5.3%。从以上检测结果分析可知，94份供试材料以TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因组合类型分布为主。

进一步分析不同等位基因组合对小麦籽粒Lox活性的影响，结果(表4)可以看出，含有TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因组合类型材料的Lox活性最高，与其余五种类型差异显著。含有TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b等位基因组合类型材料的Lox活性最低，与其余五种类型也差异显著。其余四种等位基因组合类型中，含有TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b等位基因组合类型材料的Lox活性最低，与其余三种类型差异显著。这表明TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因组合与高Lox活性相关，TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b等位基因组合与低Lox活性相关，TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b等位基因组合与中低Lox活性相关，其余三种等位基因组合与中等Lox活性相关。

表4 不同等位基因组合对Lox活性的影响Table 4 Effect of different allele combinations on Lox activity

2.4 Lox活性基因等位变异在不同省份(直辖市)供试材料中的分布频率

从表5可知，与高Lox活性相关的TaLox-B1a等位基因在来源于安徽、河南、江苏、陕西和北京小麦新品系中的分布频率分别为18.7%、 17.3%、20.0%、16.7%和25.0%，均低于与低Lox活性相关的TaLox-B1b等位基因；与高Lox活性相关的TaLox-B2a等位基因在来源于安徽、河南、江苏、陕西和北京小麦新品系中的分布频率分别为75.0%、 92.3%、90.0%、91.7%和 75.0%，均高于与低Lox活性相关的TaLox-B2b等位基因；与高Lox活性相关的TaLox-B3a等位基因在来源于安徽、河南、江苏、陕西和北京小麦新品系中的分布频率分别为 62.5%、67.3%、 60.0%、75.0%和75.0%，均高于与低Lox活性相关的TaLox-B3b等位基因。说明来源于安徽、河南、江苏、陕西和北京小麦新品种均以TaLox-B1b、TaLox-B2a和TaLox-B3a分布为主。

表5 LOX活性等位基因在不同省份材料中的分布频率Table 5 Frequency of LOX allelesin different provinces

与高Lox活性相关的TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因组合在来源于安徽、河南、江苏、陕西和北京小麦新品系中的分布频率分别为6.3%、11.5%、10.0%、8.3%和25.0%；与低Lox活性相关的TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b等位基因组合在来源于安徽、河南、江苏、陕西和北京小麦新品系中的分布频率分别为18.8%、5.8%、10.0%、8.3%和25.0%。说明来源于安徽、河南、江苏、陕西和北京小麦新品系均以中等Lox活性相关的等位基因组合分布为主。

3 讨 论

了解Lox活性基因位点不同等位基因的分布情况，可为Lox活性的分子遗传改良提供参考。前人研究表明，TaLox-B1b等位基因在新疆、陕西、黑龙江和宁夏小麦中的分布频率分别为75.90%、77.46%、88.98%和84.44%[10-13]。本研究结果表明，TaLox-B1b等位基因在黄淮麦区(南片)及其组成省份安徽、河南、江苏、陕西小麦新品系中的分布频率分别为81.9%、 81.3%、 82.7%、80.0%和83.3%。出现这种现象的原因可能是TaLox-B1b等位基因与低Lox活性相关，而低Lox活性的小麦较耐储藏[17]，而高Lox活性可以使面粉增白，各地育种家在耐储藏和面粉增白两个性状上有目的地选择了前者。张福彦等[14]利用标记Lox-B23对122份河南小麦TaLox-B2和TaLox-B3位点进行等位基因检测，结果表明，TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因的分布频率分别为57.4%和41.8%。白 璐等[15]利用标记Lox-B23对123份新疆小麦TaLox-B2和TaLox-B3位点进行等位基因检测，结果表明，TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因的分布频率分别为26.8%和77.2%。本研究检测结果表明，TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因在94份黄淮麦区(南片)小麦新品系的分布频率分别为 88.3%和67.0%。综合以上数据可知，TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因在新疆麦区和黄淮南片麦区的分布频率存在很大的差异，这可能是材料来源不同所致。

本研究通过对94份供试小麦材料Lox活性和基因型关联分析可知，含有TaLox-B1a、TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因材料的Lox活性均显著高于其对应位点上含有TaLox-B1b、TaLox-B2b和TaLox-B3b等位基因的材料。这与Geng等[8]和Zhang等[9]的研究结果一致，验证了TaLox-B1a、TaLox-B2a和TaLox-B3a等位基因与高Lox活性相关，TaLox-B1b、TaLox-B2b和TaLox-B3b等位基因与低Lox活性相关，这也验证了标记Lox16、Lox18和Lox-B23可以作为Lox活性分子标记辅助育种的有效工具。但本研究也发现，部分携带与高Lox活性相关的TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因组合小麦材料的表型值低于其他等位基因组合类型，造成这种情况的原因可能有两个，一是生态环境的影响，王 慧等[3]和吴培培等[4]研究表明，不同生态环境对小麦Lox活性存在影响，但生态环境的影响效应低于基因型的影响效应；二是小麦其他染色体上也存在影响籽粒Lox活性的基因位点，Feng等[6]和Garbus等[7]研究表明，普通小麦1A、5D和7B染色体也存在影响Lox活性的基因位点。另外，本研究中冠麦12、漯麦66和周麦49号不仅Lox活性高于80 AU·min-1·g-1，而且均携带与高Lox活性相关的TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a等位基因组合，可作为选育高Lox活性和亮白面粉品种的亲本资源加以应用，Lox16、Lox18和Lox-B23三个标记可作为小麦Lox品种改良辅助选择的有效工具进一步利用。