新型冠状病毒核酸检测实验室污染的监测与分析

黄日昇 李轶春 陈文雄 邓家庆 彭云娟

摘要：目的 通过对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测实验室的环境SARS-CoV-2核酸监测，发现潜在污染源并采取相应有效措施，消除或避免核酸检测实验室污染。方法 在2020年5月20日至2020年5月23日北海市中医医院医学检验科SARS-CoV-2核酸检测假阳性结果突发增多期间，对该实验室实行去污染源和环境SARS-CoV-2监测。结果 试剂准备区、标本制备处理区环境监测点SARS-CoV-2核酸检测阴性;扩增及产物分析一区为产物污染，环境监测点均检测出SARS-CoV-2核酸阳性，对操作台面、PA7600荧光定量基因扩增仪扩增仓、分析区空气进行14天SARS-CoV-2核酸监测，污染物清除期其CT值分别为37.0±1.41，36.8±2.03和37.0±2.16，污染物清除后观察期CT值分别为45.8±0.38，45.7±0.75和45.8±0.38，差异具有统计学意义（F=5.75，10.28，11.53 均P<0.05）。结论 SARS-CoV-2核酸检测实验室制定并落实环境监测制度，行之有效的预防或清除污染措施和应急预案对病原微生物安全防护极其重要。

关键词：新型冠状病毒核酸检测;实验室污染 ;环境监测

【中图分类号】G644.5 【文獻标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）13-02

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是一种新型β属冠状病毒，单链 RNA病毒，是引发新型冠状病毒肺炎（COVID-19）主要病原微生物，基因组序列约由29kb构成，拥有10个基因，可有效编码10个蛋白[1]。据国家卫健委公布的《新型冠状病毒的肺炎诊疗方案（试行第七版）》[2]，实时荧光RT-PCR是SARS-CoV-2确诊病例的诊断标准之一，因其具有高敏感性，特异性好，操作简单等特点，成为了疫情暴发期间最主要的实验室检测手段，广范应用于各种病原学检测领域[3-6]，但实验室也极容易引起污染。依据《病原微生物实验室生物安全管理条例》[7]、《实验室生物安全通用要求》（GB19489）[8]、《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》[9] 和《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第四版）》[10] 等要求，SARS-CoV-2核酸检测必须确保生物安全。本文旨在通过对SARS-CoV-2核酸检测实验室的环境SARS-CoV-2核酸监测，发现潜在污染源并采取相应有效措施，消除或避免核酸检测实验室污染，为SARS-CoV-2核酸检测提供建设性意见。

1材料与方法

1.1采样对象 于2020年5月20日至2020年5月23日北海市中医医院医学检验科SARS-CoV-2核酸检测假阳性结果突发增多期间，对实验室试剂准备区、标本制备处理区和扩增及产物分析一区环境监测点进行SARS-CoV-2核酸检测分析。

1.2仪器与试剂 中山达安DA7600、天隆GENTIER 96荧光定量基因扩增仪、Auto-pure32A型全自动核酸提取仪、鑫贝西生物安全柜、上海康禾H-1微型混合器、LX-300微型离心机;中山达安新型冠状病毒核酸检测试剂、广州赛百纯核酸提取试剂、H3-1采样管、带过滤芯吸头。

1.3方法

1.3.1 采样方法 于SARS-CoV-2核酸检测假阳性结果突发增多期间，实验活动与环境消毒前，物表监测点使用病毒采样拭子蘸取H3-1采样液，对操作台面、移液器表面及吸嘴、储存冰箱、传递窗把手、核酸提取仪、荧光定量基因扩增仪扩增仓、生物安全柜内壁反复涂抹，然后采样拭子回收洗脱至H3-1采样管;空气监测则使用空气沉降法，打开H3-1采样管盖子使采样液暴露于固定监测位置30Min。

1.3.2检测方法 按照SARS-CoV-2核酸检测标准程序，对核酸实验室所有工作区环境监测点进行SARS-CoV-2核酸检测，结合CT值和荧光曲线判定结果，内源性检测系统（内标，IC）曲线S型扩增，ORF1ab和N基因同时扩增（CT≤40），结果为SARS-CoV-2核酸阳性;ORF1ab和N基因无扩增（CT≥45），结果为SARS-CoV-2核酸阴性;ORF1ab和N基因无明显扩增（CT40-45），结果为检测灰区，需要重测复查;ORF1ab或N基因单通道扩增（CT≤40），重新采集标本复查，复查结果一致时，报告SARS-CoV-2 ORF1ab或N单基因核酸阳性，复查结果为双基因均阴性时，报告SARS-CoV-2核酸阴性;IC 曲线无S型扩增，需要重测或者重采标本测定[11]。所有该实验室SARS-CoV-2核酸检测阳性标本均按要求转送至北海市疾病预防控制中心核酸实验室再次复核。

1.3.3污染源清除方法 每天3次，连续7天清洗空调过滤网，对仪器设备（如基因扩增仪扩增仓与外表、生物安全柜内壁、核酸提取仪、移液器等）75%酒精擦拭，500 -1000mg/L的84消毒液擦拭工作台面、冰箱、传递窗把手，拖擦地面，作用10 min后用清水擦拭工作台面等物表，打开实验室紫外灯照射≥1 h[12-13]，保持开窗通风排气。

1.3.4污染源清除验证方法 对实验室污染区环境监测点连续14天SARS-CoV-2核酸监测，连续7天检测SARS-CoV-2核酸阴性，判定为污染源清除成功，实验室可正常使用运行。

1.3.5应急预案的启动 实验室生物安全领导小组通过环境监测结果分析污染源并进行生物安全自查，根据污染类型、范围及危害程度上报医院生物安全管理委员会，由其决定封闭污染区域，选择清除污染的方法与清除验证方法，启用备用实验用房和仪器设备，进行生物安全评估等。

1.3.6质量控制 使用中山达安试剂盒配套质控品（批号2020056）、阴性和阳性对照一同与样本检测，使用常规质量控制规则，确保可靠的实验检测质量。

1.4统计学软件分析 统计分析采用SPSS 22.0软件，计数资料以百分比（%）表示，其比较采用卡方检验，计量资料以均值±标准差（）表示，其比较采用T检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 实验区域环境监测点SARS-CoV-2核酸检测 试剂准备区、标本制备处理区环境监测点SARS-CoV-2核酸检测均为阴性，扩增及产物分析一区为产物污染，环境监测点均检测出SARS-CoV-2核酸阳性，具体见表1至表3。

2.2 污染源清除验证监测 对扩增及产物分析一区使用污染源清除和验证方法，启动SARS-CoV-2核酸检测实验室应急预案，连续14天SARS-CoV-2核酸监测，污染物清除后监测期比污染物清除监测期，CT值均值明显升高，连续7天SARS-CoV-2核酸阴性（CT≥45），差异具有统计学意义（F=5.75，10.28，11.53 均P<0.05），见表4。

3讨论

据中新网报道，新冠疫情发生以来，SARS-CoV-2核酸检测实验室由原来的2081家增加至4804家，其中1350家为新准入二级医院实验室，提高了核酸检测能力，但同时发现部分临床基因扩增实验室设计布局不合理，未能达到相应生物安全防护要求;部分实验室人员生物安全防护意识严重弱化，个人防护用品不足[14];检测人员资质不符合要求;实验人员体力及心理负担过重;生物安全手册、风险评估程序、标准作业指导书不全或缺失等问题，使SARS-CoV-2核酸检测实验室污染风险增加。

目前核酸实验室污染的主要类型有：①标本污染;②试剂污染;③产物污染。污染处理过程耗时且繁琐，所以采取有效的预防污染措施极为重要。常见预防实验室污染措施有：①实验室布局设置合理。设计有门禁系统并粘贴生物安全警示标识，至少应设置3个独立工作区域： 试剂储存区、标本制备区和扩增及产物分析区。各区在空间上相互独立，实验用品实行专区专用，处于物理分隔状态，分别设有缓冲区域。②实验室人员和物品应按照从一区→二区→三区的单向工作流向制度，不得逆向流动。③严格的人员准入进入制度。④核酸检测实验室标本制备区设置专用SARS-CoV-2核酸提取间（负压实验室，气压符合要求）进行病毒核酸提取，避免与其他核酸检测项目混用，确保生物安全。标本的开盖、取样、震荡等操作必须在生物安全柜内进行，再转移到全自动核酸提取仪进行核酸提取。该区域操作者需三级生物安全防护，严格执行防护用品穿戴程序和互相纠正程序及制度[15-17]。⑤每次实验结束后执行消毒程序，即使用75%酒精喷洒生物安全柜或其他仪器，然后用一次性纸巾擦拭;实验室台面使用1000mg/L有效氯消毒液擦拭，实验室地面采用500-1000mg/L有效氯消毒液拖地消毒（拖把分区放置，不可以共用），打开生物安全柜及实验室紫外灯消毒>2h，实验室所有垃圾均视为有传染性医疗垃圾，均需高压灭菌消毒处理。⑥重视实验室人员的身体和心理健康，适当减少轮流排班次数，注重心理辅导。⑦健全实验室质量管理体系文件，特别是生物安全管理制度。⑧制定并落实环境监测制度，包括监测频率（间隔）、取样方法、取样主要范围，任一方法/部位环境监测结果不合格，均应采取相应措施加强实验室清洁消毒，直至环境监测结果全部合格。

本文通过实验室环境监测点SARS-CoV-2核酸检测发现为扩增及产物分析区产物污染，通过实验跟踪分析发现，某厂商八联管加盖后，在重复高温变性、低温退火和延伸三个循环中盖子变形导致产物片段泄露引起产物污染，采取更换新批次八联管和使用污染源清除方法后，只用了14天就成功清除了污染源，因此環境SARS-CoV-2核酸监测为污染源的查找分析、污染类型判断提供了依据，而行之有效的预防或清除污染措施为污染源的清除提供了保障，赢得了时间。

本次SARS-CoV-2核酸检测实验室污染处置过程中，实验室生物安全领导小组迅速自查并把污染类型、范围及危害程度上报医院生物安全管理委员会，由其启用了应急预案，迅速启用了备用实验用房和仪器设备（天隆GENTIER 96荧光定量基因扩增仪），为后期SARS-CoV-2污染源清除验证和临床标本检测的正常运行提供了可靠的保障。由此可见在新核酸检测实验室规划时，实验预备用房尤为重要，我们不单着眼于满足行业标准的试剂准备区、标本制备处理区和扩增及产物分析区这三个工作区，而应该放眼于未来实验室发展扩大与应急需求，设计有SARS-CoV-2专用核酸提取间和扩增及产物分析备用区对病原微生物防护十分重要。另外制定应急预案时不单要考虑职业暴露、运输泄漏、火灾、水灾、地震等紧急情况，更要考虑实验室污染、核酸实验室人员工作突发休克等突发情况的紧急处置能力等。

值得提出的是，COVID-19为当下新发疫情，SARS-CoV-2核酸检测也是应对疫情新开展项目，本次环境环境监测点采集的样本数量有限，并不能全部反映整个实验的污染情况，对于低污染状态下评价准确性降低，未检出不代表没有污染，由此可见制定并落实SARS-CoV-2核酸检测实验室预防实验室污染措施就更显得重要。

综上所述！新型冠状病毒核酸检测实验室制定并落实环境监测制度、行之有效的预防或清除污染措施和应急预案对微生物安全防护极其重要。

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作者简介：黄日昇（1981-），男，本科学士，副主任技师，研究方向：微生物及免疫学，E-mail：HRS_9919@163.com。

通訊作者：李轶春（1974-），男，研究生学历，副主任技师，E-mail：782383597@qq.com。