淫羊藿苷对肾癌OS-RC-2细胞增殖、迁移、凋亡及PTEN/AKT通路的影响Δ

穆红光，马媛媛，姚树青，马玉斌，任玉军，杨敬芳

(1.张家口宣钢医院药剂科，河北 张家口 075100； 2.河北北方学院附属第二医院检验科，河北 张家口 075100； 3.张家口宣钢医院肾病风湿免疫科，河北 张家口075100)

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是一种肾小管细胞发生致癌性转化的疾病[1-2]。由于复发或远处转移，晚期RCC患者的5年生存率极低(5%～10%)。在诊断时，近30%的RCC患者出现转移[3]。当前，RCC的治疗方法包括分子靶向治疗，如抗血管生成的酪氨酸激酶抑制剂或哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂，这些药物已被广泛用于转移性或复发性RCC患者，但多发生严重的不良反应，且对某些患者的疗效并不明确[4]。因此，为改善RCC患者的预后，有必要充分阐明RCC发生和发展的分子机制，以及寻求新的治疗方法。磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)已被鉴定为一种新型的肿瘤标志物，在前列腺癌细胞中高表达，并由雄激素进行转录调节[5-6]。PTEN在细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、染色质调节、细胞周期进展以及某些肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。蛋白激酶B(AKT)属于跨膜受体家族，在先天免疫中起关键作用。有证据表明，AKT在肿瘤细胞中被激活，影响肿瘤细胞的增殖和迁移[7]。既往研究结果表明，抑制PTEN表达可调控下游基因AKT的水平，从而影响肺癌细胞增殖和凋亡[8]。淫羊藿苷是一种植物类黄酮苷，是在传统中草药植物淫羊藿中发现的有效药理成分，其对心脑血管系统、骨骼代谢、免疫、神经系统和性功能具有广泛的药理作用，并具有抗炎和抗肿瘤作用[9]。Wang等[10]的研究结果表明，淫羊藿苷可调控β连环蛋白表达，抑制卵巢癌细胞的细胞周期转换和细胞迁移。目前尚未见淫羊藿苷对RCC的影响及作用机制的报道，本研究拟探讨淫羊藿苷对肾癌OS-RC-2细胞的抑制作用及机制，为RCC的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞：人肾癌OS-RC-2细胞(购自上海艾研生物科技有限公司，批号为AJ6011)。

1.1.2 仪器：K3 PLUS型酶标仪、FastAmp型荧光定量PCR系统和Essential V6型凝胶成像系统(上海腾名生物科技有限公司)；Axiovert 200型显微镜(德国卡尔蔡司公司)；Attune NxT型流式细胞仪(北京昊诺斯科技有限公司)；NanoDrop 2000型蛋白定量仪(上海剑凌信息科技有限公司)。

1.1.3 药品与试剂：淫羊藿苷(武汉东康源科技有限公司，原料药，纯度为99%，批号为56692-2-5)；顺铂(武汉贝尔卡生物医药有限公司，原料药，纯度为99.5%，批号为15663-23)。RPMI-1640培养基、细胞计数试剂盒8(CCK-8)试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒和TRIzol试剂(上海谱振生物科技有限公司，批号分别为P74318、P20773-5、L59117和P08441)；荧光定量PCR试剂(SYBR Premix EX Taq)、蛋白抽提试剂盒、PTEN、AKT、β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、羊抗鼠二抗和化学发光底物试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司，批号分别为AP1096、AJ50073、ABP54442、ABP30047、ABP10005、ABP10016和AJ94221)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：(1)人肾癌OS-RC-2细胞在补充有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，培养环境为37 ℃、5%CO2、2%O2、93%N2。(2)分组。①OS-RC-2细胞组，将人肾癌OS-RC-2细胞(浓度为5×106个/ml)在10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，培养环境为37 ℃、5%CO2、2%O2、93%N2；②顺铂组，在OS-RC-2细胞组培养的基础上加入顺铂浓度为40 μg/ml[预实验计算出顺铂对肾癌OS-RC-2细胞的半致死浓度(LC50)为80 μg/ml，以1/2 LC50为实验浓度]；③淫羊藿苷低、高浓度组，分别加入质量浓度为20、40 μg/ml的淫羊藿苷[11]。上述各组每孔设6个平行样，培养72 h。

1.2.2 细胞存活率测定：将肾癌OS-RC-2细胞(每孔2×104个细胞)加入到96孔板上，各组按“1.2.1”中方法培养72 h后，每孔加CCK-8试剂10 μl，用酶标仪测量波长450 nm处的吸光度(OD)，计算细胞存活率，细胞存活率=(各实验组OD/OS-RC-2细胞组OD)×100%。

1.2.3 细胞迁移能力测定：将肾癌OS-RC-2细胞(每孔2×104个细胞)接种于6孔板中，细胞融合后，用100 μl无菌移液器进行“一”字划痕，以PBS缓冲液洗去悬浮细胞，按“1.2.1”中方法培养72 h后，用显微镜拍照，测量划痕宽度，计算迁移距离，迁移距离=0 h时划痕宽度-72 h时划痕宽度，迁移距离越大，表示细胞迁移能力越强。

1.2.4 细胞凋亡水平测定：将肾癌OS-RC-2细胞(每孔5×105个细胞)接种到6孔板中，按“1.2.1”中方法培养72 h后，收集细胞，将细胞重悬于结合缓冲液中，并加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 5 μl在25 ℃下孵育20 min，以流式细胞仪分析凋亡水平。

1.2.5 细胞PTEN、AKT的mRNA水平测定：TRIzol试剂从肾癌OS-RC-2细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA，使用PCR系统将含有cDNA模板、引物、SYBR Premix EX Taq试剂的混合物进行反应。PTEN、AKT和U6引物序列由武汉艾美捷科技有限公司合成，序列为PTEN正向5′-TTCCCCAGCAACTAC GTGAC-3′和反向5′-TCTAACAACTGAATGGGCGGG-3′；AKT正向5′-CACGTCTCAGTGCATCACAGA-3′和反向5′-GTGCAGGG TCCGAGGTCGAAT-3′；U6正向5′-CCTGTGACTGAGCCGCT CGTGT-3′和反向5′-ATCATGCAGTCTGTGTGTAACC-3′。热循环条件为94 ℃持续5 min，然后进行40个94 ℃持续10 s，60 ℃持续20 s和72 ℃持续10 s的循环。2-ΔΔCt方法用于确定PTEN、AKT的mRNA表达的相对定量。

1.2.6 细胞PTEN、AKT的蛋白水平测定：蛋白抽提试剂盒从肾癌OS-RC-2细胞中提取蛋白质后，使用蛋白定量仪定量总蛋白，通过电泳分离等量(100 μg)蛋白质，然后在300 mA下电转移至聚偏二氟乙烯膜上，在室温(25 ℃)下用5%脱脂牛奶封闭1 h后，滴加PTEN、AKT和β-actin一抗(1 ∶ 1 000)在4 ℃过夜，然后与二抗孵育2 h后，使用化学发光底物试剂盒对蛋白条带进行可视化，凝胶成像系统对蛋白条带进行灰度值分析，以定量蛋白水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 肾癌OS-RC-2细胞存活率比较

与OS-RC-2细胞组比较，顺铂组和淫羊藿苷低、高浓度组细胞存活率降低；与顺铂组比较，淫羊藿苷低浓度组细胞存活率升高，淫羊藿苷高浓度组细胞存活率降低；与淫羊藿苷低浓度组比较，淫羊藿苷高浓度组细胞存活率降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 四组肾癌OS-RC-2细胞存活率比较Tab 1 Comparison of survival rate in renal cancer OS-RC-2 cells among four groups n=6)

2.2 肾癌OS-RC-2细胞迁移能力比较

与OS-RC-2细胞组比较，顺铂组和淫羊藿苷低、高浓度组细胞迁移距离缩短；与顺铂组比较，淫羊藿苷低浓度组细胞迁移距离增加，淫羊藿苷高浓度组细胞迁移距离缩短；与淫羊藿苷低浓度组比较，淫羊藿苷高浓度组细胞迁移距离缩短，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

A.OS-RC-2细胞组；B.顺铂组；C.淫羊藿苷低浓度组；D.淫羊藿苷高浓度组；各组0 h时划痕宽度一样,72 h时划痕宽度越窄,说明迁移距离越大A. the OS-RC-2 cell group; B. the cisplatin group; C. the icariin low-concentration group; D. the icariin high-concentration group；the scratch width is the same at 0 h in each group, and the narrower the scratch width at 72 h, the greater the migration distance图1 四组肾癌OS-RC-2细胞72 h时划痕宽度Fig 1 Scratch width of renal cancer OS-RC-2 cells among four groups at 72 h

2.3 肾癌OS-RC-2细胞凋亡率比较

与OS-RC-2细胞组比较，顺铂组和淫羊藿苷低、高浓度组细胞凋亡率升高；与顺铂组比较，淫羊藿苷低浓度组细胞凋亡率降低，淫羊藿苷高浓度组细胞凋亡率升高；与淫羊藿苷低浓度组比较，淫羊藿苷高浓度组细胞凋亡率升高，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、图2。

2.4 肾癌OS-RC-2细胞PTEN、AKT的mRNA表达比较

与OS-RC-2细胞组比较，顺铂组和淫羊藿苷低、高浓度组细胞PTEN、AKT的mRNA表达水平降低；与顺铂组比较，淫羊藿苷低浓度组细胞PTEN、AKT的mRNA表达水平升高，淫羊藿苷高浓度组细胞PTEN、AKT的mRNA表达水平降低；与淫羊藿苷低浓度组比较，淫羊藿苷高浓度组细胞PTEN、AKT的mRNA表达水平降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 四组肾癌OS-RC-2细胞PTEN、AKT的mRNA表达水平比较Tab 2 Comparison of the mRNA expression levels of PTEN and AKT in renal cancer OS-RC-2 cells among

2.5 肾癌OS-RC-2细胞PTEN、AKT的蛋白表达比较

与OS-RC-2细胞组比较，顺铂组和淫羊藿苷低、高浓度组细胞PTEN、AKT的蛋白表达水平降低；与顺铂组比较，淫羊藿苷低浓度组细胞PTEN、AKT的蛋白表达水平升高，淫羊藿苷高浓度组细胞PTEN、AKT的蛋白表达水平降低；与淫羊藿苷低浓度组比较，淫羊藿苷高浓度组细胞PTEN、AKT的蛋白表达水平降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3、图3。

A.OS-RC-2细胞组；B.顺铂组；C.淫羊藿苷低浓度组；D.淫羊藿苷高浓度组A. the OS-RC-2 cell group; B. the cisplatin group; C. the icariin low-concentration group; D. the icariin high-concentration group图2 四组肾癌OS-RC-2细胞凋亡率比较Fig 2 Comparison of apoptosis rate in renal cancer OS-RC-2 cells among four groups

表3 四组肾癌OS-RC-2细胞PTEN、AKT蛋白表达水平比较Tab 3 Comparison of the protein expression levels of PTEN and AKT in renal cancer OS-RC-2 cells among four

A.OS-RC-2细胞组；B.顺铂组；C.淫羊藿苷低浓度组；D.淫羊藿苷高浓度组A. the OS-RC-2 cell group; B. the cisplatin group; C. the icariin low-concentration group; D. the icariin high-concentration group图3 四组肾癌OS-RC-2细胞PTEN、AKT蛋白表达印迹图Fig 3 Western blot of the protein expression levels of PTEN and AKT in renal cancer OS-RC-2 cells among four groups

3 讨论

RCC全球发病率每年约升高2%，化学疗法的应用显著改善了RCC的疗效，但RCC患者的预后仍然很差[12]。因此，需要发现新型的RCC治疗药物。淫羊藿苷为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿和巫山淫羊藿的乙醇提取物，具有抗恶性肿瘤作用，具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等多种作用[13]。蒋绍艳等[14]的研究结果发现，淫羊藿苷可通过上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3蛋白表达，抑制人卵巢癌细胞SKOV3增殖和侵袭并诱导其凋亡。Song等[15]的研究结果发现，淫羊藿苷通过调控沉默信息调节因子6(SIRT6)/核因子κB(NF-κB)通路抑制乳腺癌细胞迁移，从而表现出抗肿瘤活性。Kim等[16]的研究结果表明，淫羊藿苷通过上调细胞外调节蛋白激酶(ERK)的表达使人结肠癌细胞对凋亡敏感，从而诱导人结肠癌细胞凋亡，具有抗恶性肿瘤作用。文艳梅等[17]的研究结果表明，淫羊藿苷可调控磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT通路的表达，从而抑制A549细胞增殖和迁移。本研究结果显示，淫羊藿苷低、高浓度组细胞存活率、迁移距离较OS-RC-2细胞组低，凋亡率较OS-RC-2细胞组高；淫羊藿苷高浓度组细胞存活率、迁移距离较淫羊藿苷低浓度组低，凋亡率较淫羊藿苷低浓度组高，与上述研究结果一致，同时说明淫羊藿苷对肾癌OS-RC-2细胞具有抑制增殖、迁移及促进凋亡的作用，且具有浓度依赖效应。

PTEN的高表达参与多种恶性肿瘤的进化过程。研究结果表明，PTEN通过调节AKT信号通路，抑制口腔鳞状癌细胞增殖和侵袭[18]。此外，PTEN可以使黏着斑激酶去磷酸化，后者会下调有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，从而调节细胞黏附。AKT是受PTEN调节的细胞因子。Kong等[19]研究结果显示，上调PTEN表达可促进AKT的表达，进而促进子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭。AKT被认为是调节肿瘤细胞侵袭和转移的重要因子。高水平的AKT表达增加了人黑色素瘤细胞的侵袭和转移，并且这种调节可能与AKT对基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的调控机制有关[20]。AKT与MMP-2、MMP-9的表达呈明显正相关，表明在肿瘤的侵袭和转移过程中，AKT的表达上调，促进了MMP-2和MMP-9的转录表达，进而促进肿瘤组织的侵袭和转移[21-22]。本研究结果显示，淫羊藿苷低、高浓度组细胞PTEN、AKT的mRNA、蛋白表达水平较OS-RC-2细胞组低；且随着淫羊藿苷浓度的升高，PTEN、AKT的mRNA、蛋白表达水平呈降低趋势。说明淫羊藿苷可降低肾癌OS-RC-2细胞PTEN、AKT的mRNA、蛋白的表达，也说明了淫羊藿苷抗肾癌OS-RC-2细胞作用与PTEN、AKT表达之间的潜在联系。但是，尚不清楚淫羊藿苷诱导肾癌OS-RC-2细胞中PTEN、AKT表达的具体机制，需要进一步研究。

综上所述，淫羊藿苷对肾癌OS-RC-2细胞具有抑制增殖、迁移和促进凋亡的作用，其机制与淫羊藿苷可降低肾癌OS-RC-2细胞PTEN、AKT的mRNA、蛋白的表达，进而抑制PTEN/AKT通路的激活有关。