唾液作为生物标记物在口腔疾病中的应用

杨利楠综述 刘琪审校

1.遵义医科大学，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学附属口腔医院，贵州 遵义 563000

生物体液中生物标志物(biomarker)的识别和量化对于评估机体病理状态、遗传易感性和对药物或环境因素的反应都具有重要作用，其结构或功能的改变也可能提供生物系统性变化的相关信息[1]。因此，生物标志物对于疾病的预防、诊断和预后以及监测疾病的进展具有重要意义。唾液作为人体生物体液中的一种，拥有着无创、低成本、安全、易获取等优点，且因含有特定的生物标记物，非常适合疾病的早期检测。现以国内外将唾液作为诊断工具在龋齿、牙周病、口腔癌症以及全身疾病中发现的有关生物标记物做如下综述。

1 唾液

唾液是由唾液腺、龈沟液分泌形成的复杂的动态生物液体。由于其生化特性，唾液被认为是检测分子的重要生物液体，这些分子可以作为口腔疾病的生物标记物，如龋齿、牙周炎、口腔癌症以及某些全身系统性疾病[2]。与其他生物液体相比，唾液作为生物标志物的诊断工具具有很多优势。唾液内含有大约3 000种蛋白质，其中约50%的蛋白质也存在于血液中；而且，当生物标记物同时存在于血液和唾液中时，后者的水平通常更高；与血液或尿液相比，唾液收集程序只需要较少的操作和最小的不适，无论儿童、老年人甚至是残疾人都能接受。此外，唾液的处理具有较低的生物风险和操作成本，不需要大量的人力和专门设备[3]。

根据研究的目的，可以收集总唾液或单个腺体分泌的唾液，总唾液通常是生物标志物分析的最佳选择。唾液总量可以在静止时收集，也可以通过咀嚼或药物进行刺激。在收集受刺激的唾液时应特别小心，因为唾液流的长期刺激可能导致不完全糖蛋白糖基化，且唾液蛋白似乎比血清蛋白更容易降解[4]。因此，为了保存样品的蛋白质含量，唾液的收集和储存都需要进行考量。另一个需要考虑的重要因素是收集的时间，因为不同的唾液成分呈现不同的昼夜节律[5]。

总的来说，唾液是一种非常有吸引力的生物标记物液体。唾液分析提供了实时数据，目前的技术允许同时检测各种类型的生物标记。然而，唾液采集和处理的标准化是一个必须考虑的重要因素，以确保分析的可靠性。

2 龋病、牙周病、口腔癌及全身疾病可能存在的唾液生物标记

口腔和全身疾病的唾液生物标志物可能以不同的形式存在，如与疾病发生进展相关的DNA、miRNA、代谢物和蛋白质。最新提出的唾液组学包含了唾液基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、微生物组学及微小RNA等，其中储存的人类及口腔微生物的生物信息为各种口腔疾病以及全身系统性疾病的研究提供了重要信息[6]。它是口腔和全身性疾病唾液生物标志物的最新研究成果。

2.1 龋病 龋病是一种多因素疾病，由于这个特点，所以不可能由单一的生物标志物预测其风险或严重程度。唾液里丰富的蛋白质组和独特的唾液蛋白对龋齿有重要作用，唾液蛋白的多态性与龋齿风险之间的相关性在一个系统综述中进行了评估。在16项对有龋齿和无龋齿的人的临床研究中，其中11项研究中观察到龋病与抗菌活性、pH控制和细菌定植/黏附蛋白相关[7]。低龄儿童龋(ECC)是最常见的龋病，由于这种疾病易被忽视，通常得不到早期及时的治疗[8]。因此，唾液生物标记物对ECC的早期发现和预防具有重要的临床意义[9]。最近的荟萃分析已确认唾液变形链球菌是ECC的强危险因素，OR=3.83(1.81～8.09)，这意味着变形链球菌可以作为ECC发病的标记。但属于低、中度可信度，仍需进一步设计纵向研究[10]。此外，唾液中变形链球菌和乳酸菌作为ECC的预测因子显示的准确性较低，这可能是龋病病因的多因素特性所导致的，但因它们在唾液中的存在提高了多变量预测模型的准确性[11]。龋的发生与复杂的群落有关，而不是一个单一的分类单元。在唾液和菌斑中，富集的微生物大多由普氏菌组成。此外，普雷沃氏菌成员不仅能够检测ECC的发病，同时不受年龄的影响，并且对碳水化合物衍生酸的生产活动有很强的贡献，这是与龋病状态相关的最突出的微生物功能。这种基于微生物的模型能够从健康样本中诊断ECC，准确率为70%，并能以81%的准确率预测临床认为健康的样本未来的ECC值[12]。基于现有的知识，目前还不可能利用一种或一套唾液蛋白或微生物来预测的龋齿的发生。然而，文献显示一些蛋白质在易龋和无龋个体的唾液中表达有差异，这同样适用于唾液微生物。考虑到多变量龋病预测模型比单一预测模型具有更高的准确性，预测模型必须在不同人群和不同研究小组中使用前瞻性队列协议进行验证[13]。

2.2 牙周疾病 牙周病是一种多因素的疾病，通常通过临床参数(牙槽骨丧失和临床附着水平)来检测。然而，在这些参数能够检测出疾病之前，组织已经发生大量的损伤。这使得寻找一种能够简单、快速且可靠的生物标记区分牙龈炎症和牙周破坏性疾病具有特别的意义。EBERSOLE等[14]进行了一项队列研究发现牙周病患者唾液中基质金属蛋白酶-8(ΜΜP-8)、IL-6和IL-1抗氧化蛋白水平显著升高。最近一项包括6项研究的系统综述显示，与对照组相比，牙周炎患者以及较晚期牙周病患者中ΜΜP-8的浓度明显更高[15]。这些发现揭示了ΜΜP-8在牙周炎诊断中的潜在应用。这促使了一种集成的口腔诊断微流控平台(IΜPOD)的发展，它可以快速(3～10 min)测量少量(10 mL)唾液中ΜΜP-8[16]。到目前为止，已经鉴定出的疾病标志物促使了使用唾液作为牙周炎护理点(POC)诊断的主要试验的发展。其中包括生化测试、微生物测试和遗传测试，使用唾液进行无创的POC检测，使治疗可以立即开始。然而，这些新的诊断工具需与传统的诊断方法进行结合，也需要医生更多的接受[17]。此外，唾液生物标记物(特别是ΜΜP-8和-9以及骨保护蛋白)的多种组合与红色复合的牙周厌氧性病原体的组合已被证明可以提供高度准确的牙周疾病预测。这些组合必须通过传统诊断方法进行测试和验证，它们构成的生物标志物可促使牙周炎的快速POC椅旁诊断的发展。

2.3口腔癌症 口腔鳞状细胞癌(OSCC)占口腔癌的95%，拥有较高的发病率和死亡率，其原因仍可以归因于它确诊时大多是晚期[18]。在许多OSCC病例中发现，它的早期症状并不明显，所以尽管OSCC预后良好，但由于大多患者就诊时病变已到Ⅲ或Ⅳ期晚期，其5年生存率仍低于50%。因此，早期发现OSCC对降低其发病率和死亡率至关重要。组织活检是诊断OSCC的金标准，但有一定侵袭性，患者可能不愿接受,因此需要特异性和敏感的生物标志物来早期发现OSCC，筛查高危患者。唾液与口腔癌病变的直接接触，加上唾液中存在口腔的跌落细胞，使唾液分析成为寻找和识别可能的口腔癌检测生物标志物的最佳诊断工具。唾液中的基因组包括人类和微生物。唾液DNA的质量和数量都可进行测序选型和PCR检测[19]。人类50%以上的肿瘤发生存在p53基因突变，已有大量研究表明，p53基因在口腔鳞癌患者的癌组织中发生了突变[20]，且在口腔鳞癌患者的唾液中也发现了p53基因突变，说明唾液检测与组织内部检测具有很好的一致性，p53可作为快速诊断口腔癌的可靠生物学标志物[21]。许多miRNA被认为有可预见OPΜDs(口腔癌前病变)向OSCC的发展。有两项研究主要针对唾液miRNA诊断OPΜD早期恶性肿瘤的潜力进行评估，证实miRNA27b、miRNA145、miRNA181和miRNA21对早期恶性肿瘤的诊断具有显著的敏感性和特异性[22-23]。另一项研究将唾液样本与组织样本进行比较，发现唾液样本在预测恶性肿瘤方面明显优于组织样本，并且在OPΜDs唾液样本中，miRNA31在预测恶性肿瘤方面明显优于miRNA21[24]。唾液代谢组学在解释各种疾病的发病机制和发现与疾病发病或治疗干预有关的代谢改变方面至关重要。据报道，唾液苯丙氨酸、缬氨酸和乳酸水平是区分口腔癌与健康对照以及口腔癌与白斑等癌前病变的最佳预测因子。此外，这三种代谢物的混合物能以高敏感性和高特异性地鉴别口腔白斑和口腔癌[25]。因此，唾液代谢组学在各种研究中对OSCC的疗效可以呈正相关，提示代谢组学方法具有补充临床口腔癌检测的诊断价值。多种唾液生物标记物的结合在口腔癌诊断中显示增强。五种唾液生物标志物如profilin、Μ2BP、ΜRP14、CD59和过氧化氢酶对口腔癌的检测具有83%的敏感性和90%的特异性[26]。因此，唾液生物标志物的组合策略可以作为一种强有力的筛查方法，提高口腔癌及癌前病变的及时检测和诊断准确性。虽然许多蛋白质组、基因组和其他唾液生物标记物在检测口腔癌方面已有研究报道，但迄今为止还没有一个被认可用于临床。根据肿瘤发生的多因素性质，最一致的结果是通过使用多个生物标志物候选，形成一种算法，来提高准确性、敏感性和可靠性[27]。

2.4 与口腔疾病相关的全身疾病 糖尿病是全身代谢性疾病，导致葡萄糖代谢紊乱。ΜALICKA等[28]发现，糖尿病患者唾液中髓过氧化物和IgA的表达与牙周不良情况相关。研究发现，2型糖尿病和牙周炎患者的唾液褪黑素浓度降低，提示唾液褪黑素在糖尿病和牙周病的发病机制中具有重要作用，可能成为糖尿病和牙周炎诊断和治疗的重要生物标志物[29]。糖化血红蛋白和唾液葡萄糖浓度也与糖尿病患者有显著相关性，提示糖尿病患者可通过唾液监测血糖浓度[30]。心血管疾病(CVD)包括动脉粥样硬化、心肌梗死和冠心病。KOSAKA等[31]发现唾液中的炎症因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α和前列腺素E2在动脉粥样硬化和牙周病中显著增加。这些细胞因子可能是诊断牙周病和动脉粥样硬化的潜在生物标志物。此外CVD患者唾液中α-2-HS-糖蛋白含量下降，提示该肽段可能为心血管疾病的早期诊断提供新的途径[32]。尽管对阿尔茨海默病(AD)的病理组织学变化很早就已认识，但是找寻一种早期、廉价、无创的诊断生物标志物来检测特定的阿尔茨海默病病理学仍是学界目前研究热点。最近发展起来的神经影像生物标记物具有一定前景，但这些方法昂贵且会造成辐射。因此，唾液中的生物标记物将是未来诊断阿尔茨海默病的潜在手段。最近的一个系统综述纳入了16项研究，其中10项研究显示了AD患者和健康老年人之间唾液标志物的统计显著性，重点指出Aβ42(amyloid beta 1-42)和Tau和Lactoferrin为未来AD唾液生物标志物的候选物[33]。

3 结论

唾液作为“身体的镜子”，反映了机体的病理生理变化，因此成为口腔或全身性疾病诊断的一种具有潜力的生物液体。与血清相比，它们具有无创、低成本、安全、易获取等优点，因含有特定的生物标记物，非常适合疾病的早期检测。唾液诊断学作为分子诊断学更大领域的一个子集，现在被认为是生物医学基础和临床领域的一个中心角色。对人类唾液的全面分析，在病理生理状态的研究、生物标志物的发现，特别是在疾病诊断领域有很大的影响，并为确认人类疾病的潜在生物标记物提供基础，这些优势已确保广泛使用唾液作为诊断工具在临床进行实践。这一领域的未来将依赖于对疾病特异性生物标记物的进一步验证，并将其纳入最先进的分析方法中，这种方法是定量、特异性、快速可靠、敏感且经济有效的，以便在诊断项目中广泛实施。

随着先进的仪器和先进的分析技术发展，唾液组学被广泛设想为一个有用和强大的唾液生物标志物的发现方法。此外，唾液诊断的途径结合各种组学的发现，能够连接分子分析监测治疗效果，跟踪疾病进展。但在确定更多与疾病相关的唾液生物标记物以用于新兴技术平台方面，还有很多工作要做。在不久的将来，生物标志物很有可能使唾液作为一种真正的诊断液体。然而，这只有在标记的适当组合被验证和它们的可靠性被确认之后才能实现。唾液诊断领域的未来发展可以彻底改变疾病筛选方法、风险预后评估和健康状况的治疗管理的方法。这种方法有望在疾病各个时期提供更多的个体化治疗。期望在未来，唾液诊断将会完善，推动整个诊断学的发展。