蛋白质组学在番茄非生物逆境胁迫中的研究进展

王 强，王柏柯，刘会芳，韩宏伟，庄红梅，王 娟，杨 涛，

王 浩1，秦 勇2

(1.新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830091，2.新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】番茄(Solanumlycopersicum)属于茄科植物，番茄是温带作物，在不同的气候区都可种植，大多数非适宜番茄种植区采用温室栽培，不断变化的环境条件和非生物逆境胁迫，如干旱、盐碱、高温等，影响了番茄作物的生产力和产量。随着现代生物技术的迭代发展，产生了基因组学，转录组学，蛋白质组学，代谢组学等组学分支[1-3]。组学方法从有机体、组织、细胞乃至分子，提供了宏观到微观的整体视图。通过一个相对较新的生命科学分支，来提供多维生物学信息的不同组学[4-5]。另外，环境干扰的复杂性和变化性迫切需要系统生物学方法来描述基因、蛋白质和代谢产物，以正确评估由相应应激条件引起的定性和定量变化及影响。转录水平的变化并不总是反映蛋白质水平的变化，这主要归因于转录产物的降解和转录后的调控机制[1]。与基因组学和转录组学相比，其他组学分支如蛋白质组学、代谢组学尚未得到充分探索。已有的基因组/转录组学分析虽然为揭示植物响应逆境胁迫调控机制提供了一些重要信息[6-9]。但由于植物对胁迫的反应是一个复杂的过程，如涉及代谢产物的积累或蛋白质表达的翻译水平修饰，都无法通过转录组学或基因组方法进行研究[10]。其次由于存在转录可变剪切、蛋白质翻译后修饰、蛋白质相互作用、蛋白质亚细胞定位，以及基因/蛋白质的多途径调控网络；通过单基因策略和转录组研究并不能全面揭示植物体内应对逆境胁迫的机理机制，如蛋白质合成后的修饰加工、定位、蛋白质与蛋白质间的分子互作、蛋白质分子与其他生物分子间的相互作用等活动，这些都无法在基因组/转录组水平上获知。在蛋白质组水平研究响应非生物逆境胁迫机制非常必要[11-14]。【前人研究进展】近20年来，随着基于凝胶和无凝胶蛋白分离及相对定量技术(2D-DIGE，iTRAQ，无标记质谱/质谱蛋白定量)的发展和模型植物(拟南芥、番茄)以及主要作物(水稻，大豆，玉米，大麦，小麦)全基因组序列的发表，植物高通量蛋白质组学研究呈现出蓬勃发展的趋势。近年来发表的关于植物胁迫蛋白质组学的综述论文，包括植物非生物胁迫蛋白质组学综述[15]，盐、干旱和极端温度等主要非生物胁迫蛋白质组学综述[16]，低温胁迫蛋白质组学综述[17]，脱水胁迫[18]。此外，还发表了非生物胁迫下的叶绿体蛋白质组[19]、植物蛋白质组对盐的响应[20-21]。蛋白质组学在植物中的研究多集中在主要作物的胁迫反应[22]，包括水稻[23]、玉米[24]、小麦和大麦[25]，大豆[26]等温带气候下作物的逆境蛋白质组学[27]等；蔬菜作物也有一些综述报道[28]。【本研究切入点】非生物逆境胁迫是制约番茄作物生长发育、影响品质和产量的关键因素，非生物逆境胁迫是制约番茄作物生长发育、影响品质和产量的关键因素，关于蛋白质组在番茄作物中的研究报道逐年增多，蛋白质组技术本身也在不断改进。回顾近年来蛋白质组在番茄非生物逆境胁迫中的研究进展。【拟解决的关键问题】查阅国内外相关文献资料，收集与番茄作物相关的蛋白质组非生物逆境胁迫前沿研究报道。整理汇总，总结近年来蛋白质组学在番茄非生物逆境胁迫中的研究，为蛋白质组在番茄非生物逆境胁迫领域的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

采集国内外相关文献资料，收集与番茄作物相关的蛋白质组非生物逆境胁迫文献进展。

1.2 方 法

运用统计学方法汇总文献资料、官网数据等，总结分析蛋白质组学在番茄逆境胁迫的研究文献，概述其在番茄非生物逆境胁迫适应机制的研究进展。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫响应

研究表明，大量的遗传性状已被证明与这些机制有关[29]。Chen等[30]发现了一种未知的番茄盐反应蛋白在少于4 d的胁迫下的瞬时合成。他们还证明了脱落酸在大多数这些蛋白质的合成中并不起主要作用。Amini等[31]鉴定出5种受24 h盐胁迫调控的番茄蛋白，而Chen等[32]在7 d盐胁迫处理后鉴定出23种盐胁迫响应蛋白，比较了敏感和耐受基因型。部分抗氧化蛋白、热休克蛋白和碳水化合物代谢相关蛋白表达上调。Juan等[33]观察到与敏感品种相比较，耐盐番茄品种的蔗糖水平提高，相反，核糖-1,5-双磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)活性水平更低，总的RuBisCO活性得到抑制，CO2的吸收减少。Manaa等[34]证明了在盐胁迫条件下2个不同品种番茄的生理和分子的变化。植物受到胁迫表现出生长和叶片渗透势降低，而脂质过氧化(丙二醛含量)则升高。而与先前的研究相反的是RuBisCO活酶以及与光合作用相关的蛋白质RuBisCO大亚基，丙酮酸脱氢酶，葡萄糖6-磷酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶在盐胁迫条件表达水平上升。Amini等[35]研究了盐诱导的番茄蛋白质组变化，在添加0、40、120和160 mM的氯化钠营养液的幼苗处理24 d，双向电泳蛋白质组学方法检测到400个蛋白点，其中18个蛋白点在盐胁迫下表现出显著变化。值得关注的是，表皮生长因子受体蛋白(EGFR)，酪氨酸激酶超家族的成员在盐胁迫条件下表达水平增加，这也是已知的磷酸化信号转导事件的前体。过氧化氢(H2O2)也诱导表皮生长因子受体磷酸化。在盐胁迫下，活性氧(ROS)包括H2O2作为代谢的副产物形成，因此，应激蛋白EGFR的上调也可能与H2O2的解毒作用有关。M2D3.3、RAV样B结构域DNA结合蛋白和耐盐蛋白(分子量25 kDa)也在盐胁迫条件下大量增加。番茄品种Moneymaker幼苗在不同浓度氯化钠(50、100和150 mM)下盐胁迫处理，并进行双向差异凝胶电泳技术，结果鉴定出17个包括铁氧还蛋白(+)还原酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的差异蛋白，其中铁氧还蛋白(+)还原酶在盐胁迫下被诱导1.2倍，这是因为植物叶绿体硫氧还蛋白系统使用铁氧还蛋白还原酶来解毒过氧化物酶以维持细胞稳态[36]。还鉴定到了UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，它是蔗糖[37]、细胞壁多糖[38]和淀粉生物合成[39]的重要前体。

盐胁迫下，对番茄幼苗(Patio和F144)采用双向电泳结合液质联用技术分析了自由基和下胚轴的蛋白质组，检测到23种蛋白质，包括热休克蛋白、解毒酶、碳水化合物代谢、ATP合成酶、转录翻译和光合代谢[40]。此外，还评估了甜菜碱对盐胁迫诱导的外源性作用，这与已知的盐胁迫条件下的反向抑制作用类似[40]。蛋白质组学分析在2个品种中鉴定出了不同的候选蛋白，这些蛋白主要参与细胞挽救及防御[40]。Gong等[41]利用iTRAQ技术，鉴定了一组番茄根系对NaCl和NaHCO3胁迫的差异表达蛋白，共观察到313个对NaCl和NaHCO3反应的蛋白。其中，盐胁迫上调蛋白70个，碱胁迫上调蛋白114个，盐处理下调蛋白80个，碱处理下调蛋白83个。只有39个上调蛋白和30个下调蛋白被盐胁迫和碱胁迫共同存在。与盐胁迫相比，碱胁迫下调了番茄根系呼吸代谢、脂肪酸氧化代谢和氮代谢相关蛋白，上调了活性氧清除和离子转运相关蛋白。

Manaa等[42]报道了盐和钙对2种番茄基因型果实蛋白质组差异的影响。用对照溶液(3 dSm-1)或含盐溶液(7.6 dSm-1的钠/钙钠)灌溉番茄植株。在番茄果实绿色(开花后14 d)和转红2个阶段，通过双向凝胶电泳进行分离。在检测到的600个蛋白质点中，53个点在样品之间显示出显著的差异。大多数已鉴定的蛋白质参与碳和能量代谢、盐胁迫、氧化胁迫以及与成熟过程相关的蛋白质。2种基因型之间的蛋白质丰度有很大的差异，这可能与盐处理或/和果实成熟期有关。钙具有保护作用，限制了盐碱化对代谢、成熟过程的影响，并诱导植物耐盐，揭示了NaCl (Na或Ca2++Na)胁迫下番茄果实蛋白质组水平的变化，并根据蛋白质的功能及其对盐胁迫反应的响应将其与果实发育阶段联系起来。

Tang等[43]采用蛋白质组学和代谢组学方法，研究了不同成熟阶段番茄果实蛋白质和代谢产物的变化以及盐处理对果实品质的影响，成熟青果和NaCl处理的成熟果分别与成熟果相比差异蛋白有2 607和153个差异蛋白。重要的是，NaCl处理诱导了β-果糖呋喃糖苷酶和脂氧合酶的蛋白表达，这2种酶分别负责糖和挥发性芳香物质的积累。NaCl处理增加了氨基酸丙氨酸的积累和支链氨基酸转氨酶的表达，支链氨基酸转氨酶是参与酯催化合成的关键酶。NaCl处理抑制了β-半乳糖苷酶和内切葡聚糖酶的表达，提高了果实的硬度。

2.2 干旱胁迫响应

Ogden等[44]收集了干旱胁迫和恢复期番茄叶片韧皮部分泌物，分析鉴定了2 558个蛋白质，在韧皮部汁液中发现了大量已知和新发现的蛋白，以及在干旱条件下其丰度发生变化的蛋白质。新发现的韧皮部汁液蛋白包括活性氧、海藻糖代谢以及RNA沉默相关的蛋白。

Tamburino等[45]研究了番茄叶绿体对严重干旱处理的反应和随后的恢复周期。水分亏缺严重影响叶绿体蛋白质组成，主要涉及与能量相关的功能蛋白。在恢复水分循环之后，生理参数和代谢水平表明番茄植物功能恢复，而蛋白质组学显示叶绿体蛋白组成仍在进行调整，其范围甚至比干旱时期还要广泛。候选基因表达和脱落酸积累的变化表明，在特定的叶绿体-细胞核(逆行)信号转导通路的应答作用下激活并与脱落酸依赖的网络互连。通过协调核编码质体定位蛋白的表达和介导植物逆境响应，对叶绿体作为环境传感器的作用进行了概述。

Zhou等[46]利用敏感番茄品种(LA3465)和耐脱水番茄品种(LA1958)根系蛋白质组的比较分析，鉴定到蛋白质在耐受机制中起重要作用。LA1958品种鉴定到170种蛋白质，其中106种蛋白质在胁迫条件下被抑制，64种蛋白质被诱导。同样，在番茄中LA3465中，在130个鉴定的蛋白质中，104个蛋白质在胁迫条件下被抑制，26个蛋白质被显著诱导。在LA1958中，诱导了晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)和脱落酸(ABA)、胁迫和成熟诱导(ASR)蛋白。在LA3465中诱导出脱水蛋白和水分胁迫诱导蛋白3。此外，钙调素在耐受番茄品种中被诱导，但在敏感品种中被抑制。在这2个品种中，用于折叠新生和变性蛋白以及在内质网和线粒体细胞器中介导蛋白质加工和定位的蛋白质受到不同的影响。Marjanovic等[47]研究了部分根区干旱(PRD)对番茄果实的影响。从果实2个生长阶段(开花后15和30 d)的果皮组织中提取蛋白质，进行蛋白质组学分析，PRD果实的细胞壁、能量和应激防御相关蛋白的表达增加可以延长果实的生长时间，在PRD果实细胞扩张阶段，一些抗氧化酶的上调可能与其保护果实免受PRD诱导的轻度胁迫有关。

2.3 高温胁迫响应

番茄植株的生长和发育对持续或短暂高温非常敏感，高温可能导致产量急剧下降[48]。超过阈值水平的高温会对植物的生长、光合作用和产量造成不可逆转的损害[49]。严重的高温胁迫会给农作物造成永久性损害[50]。温度超过35℃会对花朵的发育过程产生负面影响，而花药是最易感的生殖器官[51-53]。高温的各种影响也取决于基因型(即耐热性或热敏性品种)。Chaturvedi等[54]使用鸟枪蛋白质组学方法(GEL-LTQ-Orbitrap MS)比较了番茄Hazera 3017中2个花粉发育阶段(减数分裂后和成熟)的热应激蛋白质组。Hazera 3017是1种对热敏感的品种，共鉴定出2 000个蛋白。在这项研究中，通过应用1种新的tMAPA策略对鉴定的肽进行定量，从而检测出51种独特的蛋白作为热响应候选物。在减数分裂后期，鉴定出晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)、冷休克蛋白1、小热休克蛋白20(sHSP20)和22个伴侣蛋白之类的蛋白。LEA是热应激的重要蛋白质标记，它参与蛋白质的正确折叠和构象(结构和功能)，LEA蛋白在应激条件下在所有发育阶段均表达，无组织特异性。此外，已知sHSP20和22在热处理减数分裂后期(小孢子和极化小孢子)起保护作用。番茄的转录分析表明编码热应激转录因子，热休克蛋白以及参与ROS清除剂过程的蛋白参与了生殖组织对热胁迫和耐热性的响应[55-57]。Mazzeo MF等[58]从2种基因型(耐热和热敏感)收集的番茄花药进行了差异蛋白质组学研究，探索胁迫响应机制并鉴定可能与耐热相关的蛋白质。结果表明，热胁迫主要影响能量和氨基酸代谢以及氮同化作用，并调节蛋白质的表达，从而保证蛋白质质量和ROS解毒。此外，鉴定了与耐热特性潜在相关的蛋白质，例如谷氨酰胺合成酶，S-腺苷甲硫氨酸合成酶和多酚氧化酶。

Zhou等[59]比较了3个番茄品种Walter LA3465(耐热)、Edkawi LA2711(中度耐热)、LA1310(热敏感)的蛋白质组。在研究中，对具有4片完全展开的叶片的幼苗进行7 d的热处理(39℃/25℃，16/8光暗周期)。结果在热胁迫下，品种Walter LA3465的牻牛儿牻牛儿还原酶、铁氧还蛋白-NADP(+)还原酶、RuBisCO活化酶、转酮酶被抑制，而胞质NADPmalic酶和超氧化物歧化酶被诱导。另一方面，在栽培品种Edkawi LA2711中，9种蛋白质(RuBisCO活化酶、黄酮醇合酶、M1家族肽酶等)被抑制，而包括亲环素、果糖1，6-二磷酸醛缩酶、转酮酶等在内的一些其他蛋白质被增加。在LA1310品种中，8种蛋白质被热抑制，4种被热诱导。结合从3个番茄品种的蛋白质组分析中获得的信息表明，在热胁迫下，像RuBisCO活化酶和S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶这样的蛋白质以及一些其他参与细胞防御、碳水化合物代谢、光合作用(例如转酮酶)的蛋白质受到抑制。Muneer S等[60]以“Super Sunload”和“Super Doterang”为接穗，以“B-blocking”为砧木在不同温度下生长的番茄植物的生理和蛋白质组学分析。共鉴定出87种对不同温度有反应的蛋白质。

2.4 低温/冷胁迫响应

低温(<20℃)或冷害(<0℃)的温度会影响植物的生长和存活，而这些条件由于组织中结冰会导致细胞脱水[61]。在这种不利条件下，植物通常会通过激活初级代谢并增加抗氧化剂和伴侣蛋白的水平来产生更多的能量。前期研究使用2-DE[62]和2D-DIGE[63]分析了低温对番茄果实的影响。低温处理的番茄果实的2-DE分析表明，在低温胁迫下蛋白质组的调节率为6%。特别是硫氧还蛋白过氧化物酶和富含甘氨酸的RNA结合蛋白(GRP)与番茄果实的低温胁迫有关[62]。另一方面，2D-DIGE对低温处理的番茄果实的分析表明，与防御相关的蛋白质，如sHSP和晚期胚胎发生蛋白。以及与光合作用和蛋白质降解机制解偶联有关的蛋白质。此外，观察到ATP合酶，26S蛋白酶体亚基RPN11和天冬氨酸蛋白酶丰度降低是对番茄果实冷胁迫的早期反应[63]。

Page等[64]研究表明，冷藏水果中上调的蛋白质与抗冻性有关，而下调的蛋白质则与冷冻过程有关。参与对低温条件的不同抗性的蛋白质是小热休克蛋白(sHSPs)和一组参与防御内质网应激胁迫的蛋白质。Vega-Garcia等[65]比较了低温贮藏的番茄和室温贮藏番茄的蛋白质谱。观察到2种与冷害有关的蛋白质硫氧还蛋白过氧化物酶和富含甘氨酸的RNA结合蛋白积累显著增加，在这2个蛋白质组学研究中，都比较了具有明显冷害症状的正常水果和受损水果的蛋白质谱，参与植物应对冷胁迫的响应机制的蛋白质无法区分。在第1个明显的冷害症状出现之前，对低温贮藏的番茄进行蛋白质组学研究，这一策略可以避免低温胁迫晚期相关蛋白的干扰。

2.5 其他非生物胁迫响应

Hattrup等[66]研究了番茄(Better boy)叶片在避光反应中的蛋白质组模式。在这项研究中，植物在室温下和遮阴环境下光照直射生长。用2-DE和nESI-LC-MS/MS对叶片蛋白进行研究。共鉴定出59个差异表达的蛋白，这是避光机制的一部分。这些已鉴定的蛋白被分呼吸作用、卡尔文循环、糖酵解、生物合成、细胞维持、应激反应、呼吸作用、光收集、细胞维持、应激反应等功能类别[66]。Ahsan等[67]对番茄叶片渍水胁迫的反应。从叶片中提取总蛋白，进行聚乙二醇分馏和双向电泳分析。聚乙二醇分馏的功效表现在叶片样品中茜草素的耗竭和低丰度蛋白质的富集[68]。渍水胁迫在番茄叶片中产生大量的活性氧。还抑制蛋白质生物合成和蛋白酶活性，蛋白酶活性在程序性细胞死亡中起主要作用，这可能是淹水胁迫下叶片衰老的一个可能原因[67]。

3 讨 论

番茄逆境胁迫处理的蛋白质组学研究仍以总蛋白质组的比较研究为主，即比较对照与胁迫处理的蛋白质组以及对特定胁迫反应不同的基因型。蛋白质组学方法通常利用二维凝胶电泳、同位素编码亲和标签(ICAT)、同位素标记相对和绝对定量(isobaric tag for relative and absolute quantification ，iTRAQ)、质谱(MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI TOF)、蛋白质印迹等结合生物信息学工具来鉴定蛋白质并绘制它们在细胞环境中的相互作用。蛋白质组学用于鉴定番茄盐胁迫[69]，温度胁迫[70]和干旱胁迫[71]有关的响应蛋白。逆境胁迫相关的蛋白质已被广泛报道，例如，利用双向凝胶电泳和MALDI-TOF / TOF MS，番茄幼苗中发现67种差异表达的蛋白质可响应高温[72]。在这项研究中，蛋白质组学分析低温胁迫下番茄品种的变化[73]，除了提取、分离和检测相关问题外，对被注释基因的高度准确和广泛的注释和高质量的GO分类仍然不足。尽管已经进行了许多蛋白质组学分析来研究番茄的非生物胁迫响应，但数据分析和解释仍然是蛋白质组学深入研究瓶颈。随着4D蛋白质组学(4D-Proteomics)的发展，最新的DIA技术(DIA-PASEF)赋予其4D蛋白质组学数据的采集和匹配能力，相比传统DIA技术数据匹配的缺失值和假阳性有效降低了，蛋白定量的准确度也更高，更有利于高通量的样本采集[74]。基于MS的方法与计算工具相结合能够同时处理数百个肽段跃迁，并具有良好的重现性、可预测性和准确性。无标签定量程序方便，且为蛋白表达全貌研究提供可靠的数据，该方法已被广泛应用于番茄品系评价[75-76]。

4 结 论

在非生物逆境胁迫条件下，番茄通过改变自身的蛋白质表达水平对各种非生物胁迫作出响应。蛋白质组学研究能够全面揭示番茄响应胁迫时其细胞内蛋白质的动态变化规律，鉴定差异表达的蛋白质，是番茄抗逆生物学研究的重要组成部分。随着高通量蛋白质组技术进步，将有更多的与番茄响应非生物逆境胁迫相关的蛋白或基因被挖掘，非生物胁迫反应的机制及在作物育种过程中鉴定和利用蛋白质标记的可能性。