超干处理延长菜豆种子寿命的生理生化机制研究

孙 璐，冯国军，刘大军，杨晓旭，刘 畅，闫志山

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

菜豆味道鲜美且营养价值高，富含蛋白质、膳食纤维、镁等元素。菜豆种子在一般条件下不耐贮藏，菜豆种子的老化和活力丧失对其种质资源保存和现实生产会造成巨大损失。长期保存种子需要贮藏温度、种子含水量2个关键控制因素。国际植物遗传资源委员会(BIPGR)把(5±1)%含水量、-18℃低温作为种子储藏保存的理想条件，目前常采用低温和超低温的方式来贮藏种质，但冷库的建设和运行成本昂贵，耗资巨大。种子超干贮藏(ultra-dry storage)是将种子水分降至5%以下（一般认为5%是种子安全含水量下限），密封后在室温下贮藏种子的技术和方法[1]，让种子含水量与储存温度两者之间有某种意义上的互补关系。研究表明，低含水量状态下的种子劣变程度降低，且在一定的含水量范围内，降低种子含水量得到延长种子寿命的效果与低温储存种子一样[2]。不同品种的种子耐干的特殊性质差异很大，对大葱[3]、芝麻[4]、落叶松[5]、黄花补血草[6]、花生[7]等植物种子超干的研究结果表明，大部分作物种子的超干处理可以减缓种子老化，种子的活力可以在长期内保持较高水准，且对种子无害。油料种子可忍受极高程度的脱水，且对活力没有影响；蛋白质类的种子以及淀粉类的种子品种间耐干能力上存在很大的差异性，如大豆、大麦和水稻[8-10]。当含水量低于某一临界点时，种子寿命缩短，甚至出现干燥受损、活力下降的现象[11]。超干贮藏技术想要得到广泛的应用，主要是确定不同品种种子超干的下限含水量。种子活力的丧失通常归因于原生质膜完整性的丧失，尽管目前尚不清楚膜损伤是种子变质的主要原因还是次要效应，但仍可以将其视为种子老化的早期症状。人工高温高湿加速老化种子经常用来测定种子活力。人工老化是人为控制种子在短时间内进行劣变老化，控制种子的活力、发芽率、发芽势等快速下降，人工老化可以模拟自然界中种子老化的过程。

本研究以菜豆种子为材料，对它们进行超干和人工老化处理，从发芽率、热稳蛋白含量、丙二醛(MDA)含量等方面对菜豆种子超干贮藏的效果进行研究，探讨菜豆种子超干贮藏的可行性，以利于菜豆种质资源的保存。

1 材料与方法

1.1 材料

由黑龙江大学园艺学团队收集和保存的菜豆种质资源筛选出‘将军’、‘紫冠’、‘热那亚’，初始含水量分别为12.44%、12.77%、11.87%，初始发芽率分别为98.67%、87.33%、89.33%。

1.2 种子超干处理及老化

在室温条件下利用硅胶干燥[12]，将种子装入尼龙网袋，置于装满硅胶的干燥器中，硅胶与种子的质量比为10:1，制备不同含水量的种子。置于40℃、90%湿度恒温箱中保温老化6天[13]。

1.3 回湿处理

对老化后的种子采取逐级回水处理[14]。将不同含水量的种子放入装有饱和CaCl2溶液、饱和NH4Cl溶液及水的干燥器中，密封，各平衡24 h，使种子含水量逐步提高。

1.4 种子发芽率、活力以及硬实率的测定

回水处理后的菜豆采用《国际种子检验规程》标准测定种子发芽率、发芽指数和活力指数[15]，种子萌发温度为20℃/25℃(12 h/12 h)，7天统计结束，每次测定50粒种子，3次重复。活力指数(VI)按式(1)～(2)计算。同时对种子的硬实率进行测定[16]。

式中，GI为发芽指数，Gt为t日后发芽数，Dt为发芽时间，Sx为发芽x天后小苗的平均胚轴长。

1.5 生理指标测定

参照张宪政[17]的方法，称取0.2 g种子，置于装有50 mL蒸馏水的烧杯中，用DDS-IIA型电导率仪测定此时的电导率(A)，然后将加有蒸馏水的种子于25℃恒温条件下浸泡24 h后，用DDS-IIA型电导率仪测定此时的电导率(B)，再将其置于沸水锅中水浴30 min，待冷却到室温后测定电导率(C)。

称取吸胀24 h的种子0.5 g，种子可溶性蛋白含量采用李合生的考马斯亮蓝G-250染色法[18]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[19]，超氧阴离子自由基(O2-)产生速率采用比色法[20]。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法，过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度计法测定，过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法[21]。

1.6 胚根细胞线粒体超微结构观察

随机选取含水量范围为12%、8.5%、6.5%和5.5%的种子样品，浸泡12 h，取种子的胚根，固定在4%戊二醛溶液中7天，放置在4℃保存。然后酒精梯度脱水，再利用四氧化锇固定，最后用树脂包埋。利用LKB8800 III超薄超微切片机切片，再用透视电镜观察切片[22]。

1.7 数据处理

各数据3次重复取平均值，用SPSS 25.0软件在P=0.05下利用LSD多重比较进行数据分析，用Excel 2016软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 菜豆种子的干燥过程

在室温条件下利用硅胶干燥法，‘将军’含水量由12.44%降至8.52%、6.95%、5.78%分别需要6、15、105天，‘紫冠’含水量由12.77%降至8.38%、6.89%、5.35%分别需要6、15、105天，‘热那亚’含水量由11.87%降至6.04%、5.95%、5.01%分别需要6、15、105天（图1）。3种菜豆种子干燥速率均呈先快后慢的变化趋势，且整体干燥进程中，‘热那亚’的干燥速度快于‘将军’和‘紫冠’，前者含水量的降低速率比后者快0.3%～2%。这可能与种子大小以及所含物质成分有关。

图1 菜豆种子在室温下的脱水速率

2.2 超干处理对菜豆种子活力的影响

随着含水量的降低，‘将军’和‘紫冠’种子均出现硬实现象，而‘热那亚’没有出现硬实。种子硬实是因种皮结构过于紧密从而导致种子吸胀能力差，这是一种让种子处于休眠状态的保护机制，菜豆种子硬实现象普遍存在，在打破种子硬实后，种子依旧可以发芽。与未超干种子相比，超干处理的3个品种菜豆种子发芽率均显著上升。当‘将军’种子由初始含水量12.44%降到5.78%时，‘将军’种子的硬实率上升至16.00%，发芽率上升了22个百分点；当‘紫冠’种子由初始含水量12.77%降到5.35%时，硬实率上升至6.77%，发芽率上升了27个百分点；当‘热那亚’种子由初始含水量11.87%降到5.01%时，发芽率上升了46个百分点（表1）。在菜豆种子老化过程中，适度的超干处理使菜豆种子的发芽率上升，但不同品种间存在差异。

表1 老化处理后超干菜豆种子萌发和活力水平

2.3 超干处理对菜豆种子胚胎线粒体细胞的影响

菜豆种子中线粒体的显微镜观察表明，在种子衰老过程中，胚胎细胞中的线粒体超微结构受到破坏，与种子水分含量有关（图2）。在含水量为5.78%的‘将军’种子中，胚胎细胞中的线粒体保持完好，清晰可见双层膜和线粒体嵴，而12.44%老化的‘将军’种子中看不到膜，且细胞呈解体状态（图2A～B）。在含水量为5.01%的‘热那亚’种子中，线粒体膜在种子中是正常的，线粒体内膜和嵴清晰可见。在含水量为11.87%的‘热那亚’种子中，种子中线粒体内膜和线粒体嵴消失，线粒体开始呈液泡状结构并分解（图2C～D）。在含水量为5.35%的老化‘紫冠’种子中，胚胎细胞中的线粒体保持完好，清晰可见双层膜，12.77%老化的‘紫冠’种子中看不到膜，且细胞呈解体状态（图2E～F）。说明超干处理有利于种子在老化过程中线粒体的保持。

图2 不同含水量菜豆种子老化胚根线粒体结构变化

2.4 超干老化处理对菜豆种子生物膜透性的影响

经过人工老化处理后，超干处理的‘将军’、‘热那亚’种子的电解质渗透率随着含水量的下降而降低，而‘紫冠’种子的电解质渗透率在各含水量之间不存在显著差异（图3）。说明在不同的菜豆品种中，超干处理对电解质渗透率的影响不同，且适度的超干处理有利于维持生物膜的完整性。

图3 不同含水量菜豆种子老化后电导率变化

经过人工老化处理后，超干处理的‘将军’种子热稳蛋白含量都显著高于对照，在含水量为6.95%时达到最高值；‘紫冠’和‘热那亚’种子的热稳蛋白含量呈上升趋势，且差异明显，在含水量在6%左右时均显著高于对照（图4）。这说明在菜豆种子老化过程中，超干处理阻止蛋白在老化过程中的变性，增加种子的抗老化能力。

图4 不同含水量菜豆种子老化后热稳蛋白含量变化

经过老化处理后，超干处理的3种菜豆品种种子的MDA含量显著低于未经超干的菜豆种子（图5）。未经超干的菜豆种子MDA含量最高，其中‘紫冠’变化最明显，未超干的‘紫冠’种子MDA含量约是含水量为5.35%种子的1.84倍。说明适度超干处理保持种子的活力，种子耐藏性得到很大改善。

图5 不同含水量菜豆种子老化后MDA含量变化

在人工加速老化过程中，超干处理后‘将军’和‘热那亚’种子O2-产生速率随着含水量的降低而显著降低，‘紫冠’脱水至6.89%时O2-产生速率呈下降趋势且显著低于未超干种子，在5.35%时有所回升，但仍显著低于对照（图6），未经超干的3个菜豆品种种子O2-含量约为含水量在5.5%范围种子O2-含量的2倍。表明超干处理后的菜豆种子抗老化能力更强。

图6 不同含水量菜豆种子老化后O2-含量变化

2.5 超干处理对菜豆种子自由基清除系统的影响

在人工加速老化过程中，与未经超干处理的种子相比，超干处理后的3个菜豆品种种子的SOD活性显著增高，说明适度超干处理可以提高菜豆种子SOD活性水平（图7）。

图7 不同含水量菜豆种子老化后SOD含量变化

在人工加速老化过程中，种子POD酶活性与未超干种子相比有不同程度的上升，且不同含水量间POD酶活性差异显著。3个品种POD酶活性在初始含水量时最低，‘将军’种子在含水量为6.95%活性最高，‘紫冠’和‘热那亚’品种种子在含水量分别为5.35%和5.01%时最高（图8）。由此可见，适度超干可以提高种子的POD活性。

图8 不同含水量菜豆种子老化后POD含量变化

在人工加速老化过程中，与未超干种子相比，超干处理的‘将军’、‘紫冠’、‘热那亚’种子的CAT活性明显增高（图9），‘将军’和‘热那亚’种子在含水量分别为6.95%和6.15%时最高，‘紫冠’种子含水量在5.35%活性最高，约是CK的1.74倍，变化明显。说明超干处理可以使菜豆种子的CAT活性显著增高。

图9 不同含水量菜豆种子老化后CAT含量变化

3 结论与讨论

菜豆种子为蛋白质类种子，籽粒大，亲水性强，且随着含水量下降，‘将军’和‘紫冠’种子出现了硬实现象。菜豆种子脱水速度较慢，‘将军’种子经过101天干燥含水量降至5.78%左右，‘紫冠’种子经过110天含水量降至5.35%左右，‘热那亚’种子经过62天干燥至含水量5%。油脂类种子的含水量安全下限比较低（一般在1%～2%），淀粉类种子的含水量安全下限一般在4%～5%[23]，而蛋白质类种子的含水量安全下限一般在3%左右，也有蛋白质较高的豌豆、绿豆、豇豆的最适含水量为6%[24]。本研究表明，‘将军’种子含水量在5.78%～6.95%时、‘紫冠’种子含水量在5.35%～6.89%时、‘热那亚’种子含水量在5.01%～6.15%时，种子老化后的各项发芽和生理指标优于自然含水量种子，可以利用室温硅胶干燥法获得‘将军’、‘紫冠’、‘热那亚’超干种子，这与其他高蛋白质类种子较接近。

热稳定蛋白积累与种子耐脱水性的获得相关[25]。朱诚[26]对超干大豆、花生种子研究中，发现超干可以提高蛋白质的热稳定性。究其原因是菜豆种子内部的蛋白质构象发生变化，或者与其他物质发生某种反应，阻止蛋白的变性并增加了稳定性。MDA就是脂质过氧化反应最重要的产物之一，也是种子老化的基本原因[27]。本研究中，老化后的超干菜豆种子MDA含量有所积累，但是膜系统完整且含量低于未超干的菜豆种子，这与程红焱[13]的研究结果相似。这可能是因为随着含水量的降低，脱水面积增大，缺乏化学反应介质，脂质拥有较强的自卫能力，可以在一定程度上抑制了种子老化过程中有害物质的积累，膜系统完整性得到保持。试验表明，超干可以提高种子贮藏稳定性，究其原因自由基清除系统SOD、POD、CAT可以清除由自由基引起的脂质过氧化。种子在贮存期间积累的有毒物质会在种子吸涨时被恢复活性的酶清除，减少了对细胞膜的损伤，种子得以萌发[28]。适度超干处理可提高菜豆种子贮藏稳定性。

就目前而言，种子超干最适合的含水量研究还没有形成完善的体系，有许多问题仍然需要不断探索。本研究也存在着一些不足，在菜豆种子的超干过程中，采用硅胶干燥的方法虽然安全温和，但干燥速率缓慢且不容易控制，获得了包括对照在内共4种含水量。如何快速安全的干燥种子且能精准控制含水量范围还是一大难题，这也是超干研究发展的方向。在超干研究中，为了加快试验进度，自然老化种子方法使用较少，基本利用50℃以上高温人工老化种子，人工老化种子虽然可以在短时间内快速控制种子的劣变，但一定程度上并不能完全代替自然老化。2种方法对于超干种子具体的影响，还有待进一步深入研究。

综上所述，‘将军’种子含水量为5.78%～6.95%时储藏较为适宜，‘紫冠’种子含水量为5.35%～6.89%时储藏较为适宜，‘热那亚’种子以含水量5.01%～6.15%时储藏较为适宜，采用超干保存技术保存菜豆种子具有一定的可行性。