梨花和油菜花挥发性气味物质的鉴定及差异分析

郭 媛，郭宝贝，张旭凤，王冰霞，武文卿，宋怀磊，郑永惠

（1山西农业大学园艺学院，太原 030031；2山西农业大学果树研究所，太原 030031；3运城市盐湖区果业发展中心，山西 运城 044000；4山西省晋中种蜂场，山西 晋中 030600）

0 引言

虫媒植物与传粉昆虫在长期的协同进化过程中形成了互惠互利的关系[1]，虫媒植物通过颜色、气味等植物性状引诱传粉昆虫帮助其完成传粉受精的繁育进程[2]，昆虫获得花蜜、花粉等物质回报，因此这些因素直接影响访花昆虫的拜访行为及传粉效率[3-4]。其中花朵气味是吸引传粉昆虫到访，获得传粉、受精的重要化学信号[5]。每种虫媒植物都有其独特的气味，本质上是通过散发的挥发性物质吸引传粉昆虫[6-7]或者趋避害虫[8-9]。许多学者研究了植物挥发性物质对于昆虫的引诱或者趋避作用，表明其在吸引昆虫传粉[10]、草食性昆虫取食[11]、寄主嗅觉定位[12-13]、植物防御行为[14-15]等方面均发挥着重要作用。

梨是中国第三大水果，仅次于苹果、柑橘。据联合国粮农组织(FAO)数据库最新数据显示，截至2017年，国内梨栽培面积约96万hm2，总产量约1653万t，面积和产量均据世界首位[16]。梨属于典型的虫媒植物，其配子体自交不亲和，自花授粉结实率低[17]，而且由于其花粉粒大[18]、粘性重，自然界的风力不能很好的传播，需要依靠昆虫来传粉。已有研究表明，梨树通过昆虫传粉可以显著提高坐果率[19]、增加产量，同时提升果实的商品性状[20]。但自然界中，昆虫并不喜欢采集梨花，尤其是存在其他竞争植物同期开花时，访问梨花的昆虫数量急剧下降[21]。梨花花粉量大且有花蜜分泌，在一定程度上这些物质回报可以达到吸引传粉昆虫并顺利实现授粉的目的[22]。油菜作为一种重要的蜜源植物，2017年全国总播种面积和总产量分别为665.30万hm2和1327.41万t[23]。现今存在的种植模式中，油菜与梨树常出现花期重叠，因此，油菜是梨树花期传粉昆虫采集的主要竞争植物[21]。因此对同期开花的梨花和油菜花挥发性气味物质成分的鉴定并进行比较分析，以期了解梨花和油菜花吸引传粉昆虫的采集行为机理，解决梨树花期授粉难题。

1 材料与方法

1.1 取样时间

2017、2018年3月25日—4月15日。

1.2 取样地点

梨花样本是采自山西省运城市盐湖区鸿芝驿镇孙余村的酥梨(Pyrus bretschneideri)，油菜花样本是采自山西省运城市盐湖区三路里乡三路里村的甘蓝型油菜(Brassia campestris)。

1.3 取样方法

1.3.1 花朵取样 梨花朵于2017年3月25—27日取样。油菜花朵于2018年3月28—30日取样。试验时间内每日9:00—18:00，选择当天刚开、雌雄蕊露出但雄蕊未散粉的花朵整花取下，放入取样瓶中并冷冻保存。每1 g为一个样本，3次重复。

1.3.2 花药取样 取样时间同花朵取样时间。选择当天开放、雌雄蕊露出但雄蕊未散粉的花朵，用镊子夹取未散粉花药整个取下，放入EP管中冷冻保存，每1 g为一个样本，3次重复。

1.3.3 花蜜取样 梨花蜜于2017年3月25日—4月1日取样。油菜花蜜于2018年4月8—15日取样。试验时间内每日9:00—18:00，用1 mm口径毛细管从花朵基部蜜腺处吸取花蜜，吸满1管，导入到1.5 mL EP管中冷冻保存，集满1 g为一个样本，3次重复。

样本取样完成后寄往上海生工生物工程（上海）股份有限公司进行花朵、花药和花蜜中挥发性气味物质的检测。

1.4 固相萃取装置

色谱仪(HP 7890Agas)，质量选择性检测器(5975C)，手动萃取固定器，萃取纤维(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，固相萃取试剂瓶(50 mL)，隔膜（18 mm×1.27 mm，聚四氟乙烯/硅胶），密封圈（铝，中心开口式）。

1.5 试验方法

萃取纤维在GC注射器中以不分流进样模式270℃加热1 h后，样品转移到固相微萃取试剂瓶的顶部，立即使用密封圈和隔膜封口。将装有样品的萃取瓶浸入80℃水浴中，用隔膜穿孔针刺破瓶隔，下压活塞，使纤维置于顶端样品之上，并在50℃下吸附30 min。完成后抽回纤维头，并将萃取头插入GC-MS仪的气相色谱进样口，推出纤维头，250℃解吸5 min，完成进样。

1.5.1 GC条件 DB-WAX弹性毛细管柱(60m×0.25mm×0.25 μm)，载气He流量1.0 mL/min，不分流，进样口温度250℃。柱温起始温度50℃保持1 min，以6.5℃/min升至100℃，保持1 min；以10℃/min升至130℃，保持1 min；再以7℃/min升至150℃，保持1 min；最后以10℃/min升至250℃，保持5 min。

1.5.2 MS条件 接口温度230℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，传输线温度280℃。40～550 amu之间全范围扫描。

1.6 梨和油菜传粉昆虫调查方法

2017年3月25—27日选择山西运城市盐湖区泓芝驿镇同期种植梨树和油菜的地块，梨树选定3棵树，油菜划分5 m×10 m的观察样方，每天6:00—18:00网捕进入观测样地内的昆虫，共调查3天，将田间采集的昆虫装入50 mL离心管中，实验室内对昆虫进行数量统计和分类鉴定。

1.7 数据分析

通过检索NIST.11标准谱图库质量谱图确定化合物，运用峰面积归一化法求得各成分相对含量。用SPSS 22.0进行对梨花挥发性气味物质进行主成分分析并得到相关主成分载荷矩阵。

2 结果与分析

2.1 梨和油菜全花、花药和花蜜中挥发性气味物质成分比较

由表1可知，梨花中共含有气味物质9种，其中花药含7种、花蜜含4种；2种植物中含共有气味物质5种，分别是乙醇、十甲基环戊硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷、十四甲基环庚硅氧烷和六甲基环三硅氧烷。油菜全花、花药、花蜜中所含挥发性气味物质种类均高于梨花，共含有气味物质23种，其中花药中含16种、花蜜中含5种；2种花中均是花药比花蜜气味物质更丰富。

表1 梨、油菜挥发性气味物质成分及相对含量%

续表1

梨花中相对含量最高的是十二甲基环六硅氧烷、乙醇和苯甲醛。油菜花中相对含量多的是苯丙腈、十二甲基环六硅氧烷和5-氰基-1-戊烯。

2.2 梨花、油菜花挥发性气味物质分类及比例分析

将梨花、油菜花中挥发性气味物质进行归类，由图1～2可知，梨中气味物质有氧烷类、醛类、酯类、醚类、醇类5类，氧烷类占44%以上，油菜花中最多的酯类物质梨花中没有检测到。油菜中气味物质有10类，分别是酯类、氧烷类、腈类、硫醚、醛类、酸类、碳氧化物、醇类、烯类、氰化物，占比最多的是酯类和氧烷类。

图1 梨花挥发性气味物质比例分布图

图2 油菜挥发性气味物质比例分布图

2.3 梨花、油菜花挥发性气味物质主成分分析

2.3.1 各指标的标准化处理 为防止所测数据在量纲和数量级上的差别对主成分分析造成影响，对数据进行了标准化处理，使所测数据具有可比性。数据处理方式依据式(1)进行。

2.3.2 梨花朵挥发性气味物质主成分分析 从表2可以看出，第1主成分和物质1、2、6、7、8、9呈正相关，主要为氧烷类、酯类、腈类、醚类，和苯甲醛呈负相关，主要贡献物为二甲基硫醚、十四甲基环七硅氧烷、苯丙腈、二氧化碳、乙醇、苯甲醛。第2主成分和十二甲基环六硅氧烷呈正相关，其也是第2主成分主要贡献物。第1成分的贡献率为75.98%，第2成分的贡献率为24.02%。2个成分的累计贡献率已经达到100%，说明该数据的变化趋势符合分析要求。

表2 梨花花朵挥发性气味物质主成分载荷矩阵

2.3.3 油菜花朵挥发性气味物质主成分分析 从表3中可以看出，第1主成分和物质8、9、10、19、22呈正相关，主要为醛类、氧烷类、烯类、酯类等物质；和5、17、18呈负相关，主要为酯类、腈类和醚类；主要贡献物为反-2-己烯醛、异硫氰酸-2-苯乙酯、4-异硫氰酸根合-1-丁烯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚和十八甲基环九硅氧烷。第2主成分与物质2、6、11、14呈正相关，主要为醇类、醛类和氧烷类；与物质15、16、20、21呈负相关，主要为酸类、醚类和酯类物质；主要贡献物为乙醇、甲基烯丙基氰化物、辛酸、癸酸甲酯和二甲基四硫醚。第1成分的贡献率为51.523%，第2成分的贡献率为48.477%。2个成分的累计贡献率已经达到100%，因此该数据的变化趋势能较好地反映原始信息，符合分析的要求。

表3 油菜花花朵挥发性气味物质主成分载荷矩阵

2.4 梨花、油菜花气味物质与传粉昆虫相关性分析

传粉昆虫调查发现试验地共有传粉昆虫4目10科11种，但梨和油菜传粉昆虫数量有显著差异(P<0.05)。梨树平均每天有传粉昆虫20只，油菜每天平均有196只。将梨、油菜花朵所含挥发性气味物质成分与传粉昆虫数量进行相关性分析，并未发现各种成分与昆虫数量呈显著相关性。

3 结论与讨论

异花授粉植物与传粉昆虫协同进化的过程中，通过花朵形态、颜色、大小、气味、分泌花蜜、散发花粉等方式来吸引传粉昆虫，其中除了花蜜、花粉等食物报酬的因素，一些昆虫主要通过嗅觉而不是视觉吸引进行传粉[24]，不同的传粉昆虫对气味敏感度也有很大差异[25]。油菜花气味物质成分种类和数量均比梨花丰富很多，可能是吸引更多传粉昆虫的原因之一。而且不论是油菜花还是梨花，大多数气味物质都是由花药提供，说明花药是花朵气味的主要来源。

本研究表明，油菜花中含量及比例较高的挥发性化合物是氧烷类、酯类及苯丙腈，气味贡献物主要来自于反-2-己烯醛、异硫氰酸-2-苯乙酯、4-异硫氰酸根合-1-丁烯、二甲基三硫醚、二甲基二硫醚等化合物；梨花中含量及比例较高的是氧烷类、乙醇、苯甲醛，气味贡献物主要来自于二甲基硫醚、十四甲基环七硅氧烷、苯丙腈、苯甲醛等化合物。有研究表明，苯乙醛对鳞翅目昆虫具有引诱性[26]，苯甲醛是一种广泛存在于蜜源植物中的挥发性化合物，但其对金斑蝶的吸引力要显著弱于桉树脑、α-蒎烯等化合物[27]，芳香族化合物可以吸引传粉昆虫[10]，说明挥发性化合物在吸引传粉昆虫中发挥了重要作用。但各种气味成分相互作用是一个较为复杂的过程，而且气味物质成分与温度、湿度、光照、水肥管理、栽培条件以及品种等多种因素有关，因此李中珊[28]所测梨花气味物质与本研究差异较大。

梨花是异花授粉作物，但访花昆虫数量较油菜花极少。梨花和油菜花气味物质中含有5种共有物质，梨花中另有4种气味物质是油菜花中未检测到的，梨花中的这4种气味物质是否对传粉昆虫具有趋避作用，还是由于相较于油菜，梨花花蜜分泌较少，从而导致梨花传粉昆虫数量少，这些仍然需要后续开展深入的研究进一步验证。

传粉昆虫通过嗅觉感知蜜粉源植物的存在并进行采集，这对于异花授粉作物的结实至关重要。本研究比较了梨和油菜花的挥发性气味物质并分析了2种作物挥发性气味物质的差异，研究结果可为解决梨树授粉中存在的难以吸引传粉昆虫的问题，找出对昆虫有吸引力的气味物质，进而通过喷施化学物质来达到吸引更多昆虫的目的提供一定的研究思路。