植株叶绿素a和叶绿素b无损检测系统研究与开发

杨张青，李国强，张玉民，苏伟波，吴建中，段铁城,3，齐 磊

（1河南省农业科学院农业经济与信息研究所，郑州 450008；2河南农大迅捷测试技术有限公司，郑州 450002；3河南农业大学，郑州 450002）

0 引言

氮素是作物生长发育过程中不可缺少的重要营养元素之一[1]。为了使作物保持适宜的氮素水平，在作物不同生育期合理施用氮肥非常重要。适量施用氮肥能提高作物产量、蛋白质含量，并改善加工品质；但过量或不合理施氮不仅不能达到高产、优质的目的，还会使作物茎叶徒长，降低氮肥利用率，增加氮肥损失，并造成环境污染[2-4]。中国农作物化肥使用总量从1980年的1269.4万t/年增加至2014年的5995.9万t/年，而且重氮肥轻磷、钾肥的现象比较严重[5]。但中国对氮肥的利用率仅为30%左右，远低于发达国家60%～70%的利用率，导致了严重的环境污染[6-8]。

氮化物主要集中在作物生命活动旺盛的区域，如叶片、分生组织等。植物叶片中70%～80%氮素存在于叶绿体内，所以叶片中叶绿素含量的高低和氮素关系密切[9-10]。植株叶绿素含量传统分析采用分光光度法，其中普遍使用的是Arnon法[11]，该法在测定时需要采摘并破坏植株叶片，检测过程操作繁琐，不利于对植株叶片的田间快速无损监测。为了克服上述缺点，近年来作物叶绿素无损诊断技术受到人们青睐，目前多采用高光谱遥感、叶绿素荧光、叶绿素仪等分析技术，其中叶绿素仪分析技术包括透射式和漫反射式叶绿素仪检测技术[12]。透射式叶绿素检测技术采用叶绿素指数或叶色值表征植株叶片叶绿素含量高低，文献报道中具有代表性的是SPAD-502叶绿素仪[13-15]（Minolta，日本），该叶绿素仪基于朗伯比尔定律原理，采用650 nm和940 nm 2个波长进行检测，克服了单一波长受植株生物量、环境背景干扰等的影响，提高了叶绿素光谱诊断的精度[16]。但是该类型的叶绿素仪在应用性研究中还存在一些缺点：（1）由于叶绿素仪依据光透射原理进行设计，在检测叶绿素含量较高的叶片时光基本透射不过去，导致仪器测值变化不明显，如当SPAD值超过50时，测量精度显著降低，而作物SPAD值在生育期达到50的情况很常见，使得其应用推广受到限制[17-18]。（2）该叶绿素指数与叶片叶绿素总量虽有显著相关性，但是尚未实现直接输出植株叶片叶绿素a和b值，而叶绿素a和b的比值是作物病理诊断和栽培管理的重要参数之一。漫反射式叶绿素检测技术基于光学漫反射理论进行检测系统设计开发。2015年河南农业大学的魏凯等[19]探究了葡萄叶片YN-FS-1型便携式漫反射叶绿素仪测值XJI与全氮的关系。古东东等[20]搭建了三波长检测装置，分析了3个品种玉米叶片叶绿素含量与KM值的相关性。本研究将继续深入优化光路系统结构设计，提高测试结果的准确性；通过漫反射吸光度建立叶绿素a和b数学模型；进行小麦、玉米和花卉等植株叶片检测和数据分析，以期为大田作物、花卉栽培氮素施肥提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

气浴恒温振荡器（金坛市城东新瑞仪器厂）、紫外-可见分光光度计（南京菲勒仪器有限公司）、电子天平（梅特勒托利多集团）、光谱仪定标白板（海洋光学）、透光度75%消光片、25 mL刻度试管、80%乙醇（分析纯）、蒸馏水。

1.2 检测系统工作原理

1.2.1 Kubelka-Munk函数 基于Kubelka-Munk光学漫反射理论应用于植株叶片叶绿素检测可概述为：当一束平行光垂直照射到植株叶片时，这一束平行入射光与物体内部组织结构发生折射、反射、吸收和散射4种现象后，剩余的光携带有丰富的叶片内部组织结构信息并在叶子表面产生漫反射现象，利用这一光学现象，借助光电探测器进行漫反射光检测可间接获得叶片内部组织结构信息。与漫反射光相比，光透射受液体样品的浓度、固体样品厚度等因素影响，因此透射光无法对一定厚度的固体样品进行定量测定，相反，漫反射不受样品或待测物厚度的影响，在检测固相样本时更为可靠。由于Kubelka-Munk理论的K-M函数式推导过程是在6个条件同时满足的理想情况下完成的：（1）一束平行光垂直入射；（2）物体表面无限大；（3）物体厚度无限厚；（4）物体表面粗糙不平，无镜面反射光；（5）这束光在物体内部和表面产生了完全的散射和吸收；（6）吸收系数K和散射系数S均为常数。因此，基于漫反射光学理论的应用性研究，还需要在理论指导下根据实际情况进行拓展性应用。在实际应用中，为了保证反射率不受物体厚度改变而变化，测量都是在该物体厚度足够厚的层上进行，实际测量中物体厚度约1 mm厚就能满足该条件。因此，用R∞代表物体反射系数，计算见公式(1)。

其中，F(R∞)称为Kubelka-Munk(K-M)函数或者remission函数。

由公式(1)可推导出R∞的公式(2)。

1.2.2 漫反射吸光度 漫反射吸光度A定义为公式(3)。

1.3 检测系统设计

该检测系统主要围绕光电检测、信号转化、数据处理和人机交互4个功能开发。其中，光路系统由光源、传感器、反射板、定位板、避光组件等组成；选用内置A/D转化器的单片机为数据采集和处理器，由模拟信号转化为数字信号并输出显示，以数据组的形式存储至SD卡，并实现USB接口与电脑通讯。检测系统示意图和电气图分别如图1和图2所示。

图1 检测系统示意图

图2 检测系统电气图

1.3.1 光路系统 光路系统采用3光源3光束垂直照射植株叶片的设计思路，使得3束光在叶片上呈现的光斑实现最大面积的重叠，重叠区的信号比例达到最大。光路组件侧面45°陷阱式结构设计，如图3所示，在陷阱内、检测器前端安装透镜对漫反射光进行汇聚，以增强信号采集。光电传感器将采集到的光信号进行对数运算并放大后送给A/D转化，经A/D转化后的数字信号由液晶显示实现漫反射光强值输出。光路组件密封性要求达到避免外界光干扰的目的，加工材质选用黑色ABS，组件分为光源发射、探测部分和漫反射白板内陷及固定部分，两部分之间用硅胶垫密封，避免夹住叶片时漏光。漫反射光路示意图如图3所示。

图3 漫反射光路系统结构图

1.3.2 光电检测及数据采集 第一波长为峰值波长645 nm的LED光源，第二波长为峰值波长663 nm的LED光源，第三波长为峰值波长940 nm的LED光源。以下分别简称第一波长、第二波长和第三波长。光电检测在封闭暗室中进行，不能受到外界光或太阳光的干扰，由于第一波长和第二波长分别是叶绿素b和a的最大吸收波长，叶片颜色深浅不同而产生不同程度的吸收，光电传感器接收到的漫反射光信号强弱与叶片叶绿素含量高低呈现高度一致性。检测系统开机：（1）分别调整第一、二和三波长的限流电阻使得AD输出值接近满量程且3个波长的值基本一致，满足要求后不得再调整限流电阻；（2）先夹住漫反射标准白板，分别获取第一、二和三波长的AD输出值作为原始值；再检测3个光源均熄灭时系统的暗电流值，每次测量均扣除该本底值；然后夹住叶片进行测量，第三波长的漫反射值为动态参照值，用于扣除叶脉、叶片表面状况和内部生物组织结构等因素的影响。

2 结果与分析

2.1 检测系统稳定性和重复性

以透光度75%的消光片为标准，对该检测系统进行稳定性和重复性测试和评价，评价参数为3个波长的光强值。（1）系统稳定性检测方法：以透光度(T)75%的消光片水平放置检测窗口固定位置20次检测，记录第一波长、第二波长和第三波长的光强值Is1、Is2和Is3。（2）系统重复性检测方法：以透光度75%的消光片重复水平放置至检测窗口进行20次检测，记录第一波长、第二波长和第三波长的光强值Is1、Is2和Is3。该检测系统稳定性检测RSD≤0.39%，n=20；重复性检测RSD≤0.59%，n=20。数据详见表1。

表1 检测系统的稳定性和重复性(n=20)

2.2 植株叶片叶绿素a和b测定

2.2.1 试验方案 选取生长季节舒展开的第1、2、3片叶子，叶色均匀，尽量避开主叶脉、虫斑、病害斑，破损部位。同时进行Arnon法和叶绿素检测系统无损测定方法（以下简称漫反射法）进行叶绿素测定。

（1）漫反射法。按压仪器检测头夹住植株代表性叶片，按“确定”键进行测定，并记录叶绿素a和叶绿素b单位面积含量值(mg/cm2)。

（2）Arnon法（又称阿尔诺法，常规法）。从植株上选取有代表性的叶片（避开粗大叶脉、病虫害部位和灰尘特别多的叶片）打孔取样，打孔器半径为7 mm，准确称取0.2 g样本，用镊子夹住放入25 mL离心管中，然后量取80%乙醇25 mL，盖盖子60℃空气浴提取，或者室温25℃下避光放置24 h，颜色较深叶片视情况而定，至叶片全部褪绿为止。以80%乙醇为参比溶液，在紫外-可见分光光度计上机测定，记录波长663、645 nm处测定的吸光度值，计算见公式(7)～(10)。

式中，Ca为叶绿素a的浓度(mg/L)，Cb为叶绿素b的浓度(mg/L)，a为叶绿素a的含量(mg/cm2)，b为叶绿素b的含量(mg/cm2)，S为选取代表性叶片的叶面积(cm2)。

2.2.2 2种检测方法的对比分析 共采集小麦样本50个，玉米样本95个，9种花卉样本344个。分别进行叶绿素a和叶绿素b的漫反射法和Arnon法直线回归，两者的相关性均达到极显著水平，用***表示。详见表2。

表2 11种植株样本2种测定方法的数据分析

2.2.3 玻璃翠叶片的测定 选取玻璃翠叶片10片，进行漫反射法和Arnon法的对比实验，叶绿素a和叶绿素b值详见表3。

表3 玻璃翠叶片2种测定方法叶绿素a和叶绿素b值 mg/cm2

对2种检测方法的Chl a和Chl b分别进行回归分析。Chl a为y=0.570x+1.189，r=0.966***；其中x表示漫反射法Chl a单位面积含量值，y表示Arnon法叶绿素a值。Chl b为y=0.299x+0.671，r=0.939***；其中x表示漫反射法叶Chl b单位面积含量值，y表示Arnon法Chl b值。漫反射法和Arnon法的Chl a和Chl b均达到极显著相关，该检测系统适用于玻璃翠花这类特殊厚度叶片的检测。

3 结论与讨论

3.1 讨论

植株叶绿素无损诊断技术在作物氮素营养诊断及推荐施肥中具有重大意义，其中Chl a和Chl b的比值是作物病理诊断和栽培管理的重要参数之一。依据仪器工作原理叶绿素仪分为透射式和漫反射式。因其小巧、便携，便于农业科研田间使用，该仪器具有较好的市场前景。其中，透射式叶绿素仪在国内外农业科研领域使用较多，但由于其检测叶绿素含量较高叶片时光基本透射不过去，导致仪器测值变化不明显，该缺陷致使其应用受限。为了解决该问题，国内以河南农业大学段铁城教授为首的研究团队率先进行了漫反射式叶绿素检测技术研究，古东东等设计的3波长检测装置用于玉米叶片叶绿素含量与KM值相关性研究取得了重大进展，但是尚未实现直接输出植株叶片叶绿素a和b值。为了实现该目的，同时，进一步提高测试准确度，本研究从2个方面进行了深入研究：（1）光路设计上采用陷阱式3光源3光束垂直照射，实现3束光投射在叶片上光斑最大面积重叠，从根本上提高重叠区信号采集率，解决测试精度问题。（2）在数据建模上引入漫反射吸光度计算公式和良好线性区间，以国际上通用的Arnon法为参照，借助偏最小二乘法、矩阵等分析法，进行了漫反射和Arnon 2种检测方法吸光度值的回归分析。（3）以巨厚型玻璃翠叶片为样本，测试了叶片厚度对检测结果的影响，结果表明漫反射法在叶片测试时不受叶片厚度的影响，本研究基本上解决了透射式叶绿素仪的使用缺陷。基于光学漫反射理论的植株叶片叶绿素无损诊断技术极具发展前景。

3.2 结论

本研究基于光学漫反射理论构建3光束垂直入射和侧面45°陷阱式光电传感器数据采集的光路设计，研究检测系统设计中的关键技术，初步建立了植株叶片叶绿素a和叶绿素b的数学预测模型。采集小麦、玉米和花卉等植株叶片进行漫反射法与Arnon法叶绿素a和b值检测，分别进行2种检测方法的Chl a和Chl b测值回归分析，两者的相关性均达到极显著水平。大田作物、花卉等叶片厚度一般不超过1.2 mm，但一些特殊花卉如玻璃翠的叶片厚度可达3.0 mm以上，为了检验漫反射法是否适应对于这类厚度特殊的花卉，选取玻璃翠叶片进行2种检测方法的测定，结果理想。