miR-128-3p信号轴介导AXIN1调控Wnt/β-catenin通路抑制帕金森海马神经元凋亡

张广萍 任德帅 陈团团 姜岩 杜姝

【摘 要】目的：探讨HIF-1α/miR-128-3p和AXIN1在海马神经元凋亡中的作用，旨在阐明缺氧诱导因子miR-128-3p轴在MPTP所致PD小鼠海马神经变性中的作用。方法：通过腹腔注射MPTP进行PD小鼠模型的建立，利用RT-PCR技术、Western Bolt和TUNEL染色检测小鼠海马脑组织HIF-1α/miR-128-3p、AXIN1表达与凋亡。结果：AXIN1在PD小鼠模型中高表达，而HIF-1α呈低表达；HIF-1α/miR-128-3p过表达可以使Axin1下调，而Wnt/β-catenin蛋白表达升高。结论：HIF-1α/miR-128-3p轴上调可通过抑制Axin1和激活Wnt/β-catenin信号通路抑制MPTP损伤小鼠海马神经元凋亡。

【关键词】帕金森；miR-128-3p；AXIN1；Wnt/β-catenin；凋亡

帕金森病（Parkinsons disease，PD）是一种常见而复杂的神经退行性疾病，主要以静止震颤、肌肉强直以及运动迟缓等为主，其发病与氧化应激、氧气葡萄糖供应不足以及黑质致密区多巴胺神经元进行性丢失有关[1]。PD的病因尚未完全阐明，以中枢神经系统不同部位变性为主，尚有其他临床特点，如进行性核上性麻痹（PSP）、纹状体黑质变性（SND）、ShyDrager综合征（SDS）及橄榄脑桥小脑萎缩（OPCA）等[2]。miRNAs可以通过调节PD小鼠模型中黑质多巴胺能神经元来影响PD的进展。本研究探讨HIF-1α、miR-128-3p和AXIN1在海马神经元凋亡中的作用，旨在阐明缺氧诱导因子HIF-1α/microRNA-128-3p（miR-128-3p）轴在MPTP所致PD小鼠海马神经变性中的作用，为临床上治疗PD提供理论依据。

1 实验方法

1.1 构建模型与转染

取健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射稀释后的MPTP溶液，按每千克30mg/次/天，连续进行5d。如果出现倦怠、烦躁、震颤、运动迟缓等形态特征表明PD模型构建成功。将小鼠随机分为正常对照组、PD模型组、HIF-1α/miR-128-3p组、AXIN1组，收集小鼠血清以及脑组织进行细胞转染，然后进行各项指标检测。

1.2 RT-PCR技术

采用TRIZOL试剂盒进行提取组织或细胞总RNA，并检测浓度，按照反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，设置条件为：95℃预变性4 min；95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30s，共30个循环。放入荧光定量PCR仪检测，采用 2-ΔΔCt法计算HIF-1α/miR-128-3p、AXIN1表达水平。

1.3 TUNEL法

将获取的小鼠脑组织经过切片、脱蜡、水化、TBS洗涤室温孵育等处理后，双蒸水洗片，滴加TUNEL反应液并保持在37℃下孵育90分钟，室温后洗涤，加正常山羊血清封闭20分钟。去掉血清后加入转化的POD溶液于37℃下留置30分钟。TBS洗涤后加入显色液，待阳性细胞核染成棕黄色时用双蒸水冲洗，终止反应，在光学显微镜下观察。

1.4 Western Bolt

按照说明书采用RIPA提取组织或细胞蛋白，裂解离心后用BCA试剂盒检测样本蛋白浓度。

2 统计方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计数资料采用（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（χ±s）表示，进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 MPTP诱导下各指标的表达情况

利用qRT-PCR和Western blot分别检测小鼠脑组织中各指标的RNA和蛋白质表达情况发现，相比于正常组AXIN1呈高表达，而HIF-1α、 miR-128-3p呈低表达（P<0.05）。

3.2 过表达的HIF-1α/miR-128-3p下调AXIN1激活Wnt/β-catenin信号通路利用TUNEL法检测

与正常组相比PD组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与PD组相比，注射过表达HIF-1α/miR-128-3p组小鼠脑组织神经元凋亡率明显下降，Wnt/β-catenin蛋白的表达显著升高（P<0.05）。由此可知过表达的HIF-1α/miR-128-3p通过下调AXIN1激活Wnt/β-catenin信号通路从而调控PD引起的神经元凋亡。

4 讨论

迄今为止，随着对PD研究的不断深入，其病因倾向于与年龄老化、环境因素、家族遗传性以及遗传易感等综合因素有关。年龄老化：PD多发生于中老年人群，通常40岁前发病的可能性较低，而随着年龄的增长，黑质多巴胺能神经元、酪氨酸氧化酶和多巴脱羧酶活力，纹状体多巴胺递质水平随年龄增长逐渐减少，PD的发病率会出现明显的增长，而仅少部分的老年人患此病，表明生理性多巴胺能神经元蜕变不足以致病，年龄老化只是促发因素之一，但仍然存在着密切的关系[3]。环境因素：据临床流行病学数据表明，PD的患者分别存在一定的地区差异，因此人文在一些环境中，某种具有毒性的物质会对大脑神经元造成损伤，加重了PD的发病[4]。家族遗传：医学家们在长期的实践中发现帕金森病似乎有家族聚集的倾向，有帕金森病患者的家族其亲属的发病率较正常人群高一些[5]。遗传易患：近年在PD患者中曾发现a共同核素基因的Alα-53THr突变[6]。

microRNAs（miRNAs）是神经系统发育、功能和疾病的关键因子，某些miRNA，如miR-124和miR-128，在神经元中高度表达，并且在脑胶质瘤患者中被HIF-1α上調[7]。而HIF-1α作为调节细胞缺氧反应的主要转录因子，是PD进展的重要标志物，还可以通过促进细胞存活信号，对某些神经退行性变发挥治疗作用[8]。而Wnt作为一个关键的信号级联调节PD的几个细胞过程，包括分化，神经元存活，神经发生和神经保护[9]。β-catenin在人脑中表达，是Wnt信号通路的重要组成部分，参与PD的病理生理[10]。同时，AXIN1负性调节典型的Wnt信号通路，和Wnt/β-catenin信号通路之间的相互作用在细胞凋亡中起着中心调节作用，因此被认为是参与PD发病的新基因之一[11，12]。与此同时，研究认为AXIN1是miR-128的靶基因，有望成为PD的治疗候选基因[13]。通过假设HIF-1α/miR-128-3p轴可能通过调节AXIN1和相关的Wnt/β-catenin信号通路对PD病理学产生影响[14]。

本研究表明，HIF-1α/miR-128-3p轴上调可通过抑制Axin1和激活Wnt/β-catenin信号通路抑制MPTP损伤小鼠海马神经元凋亡。HIF-1α具有神经保护作用，可能用于PD的治疗，预测HIF-1α同样可能干扰特发性PD的发病机制，并改善PD患者的临床预后，HIF-1α/miR-128-3p的升高可能成为PD患者治疗的新靶点[15]。AXIN1有望成为PD的治疗候选基因，正在进行的临床前研究应最终为这种方法在帕金森病的疾病改良治疗中的临床应用开辟前景。

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基金项目：《miR-128-3p信号轴介导AXIN1调控Wnt/β-catenin通路抑制帕金森海马神经元凋亡》（CSFGG-2020005）。