冬凌草甲素对高脂饮食诱导幼龄大鼠非酒精性脂肪肝的作用及相关机制

郑文博，赵 瑛

(1.陕西中医药大学第二附属医院儿童神经内分泌科，陕西 咸阳 712000；2.西安医学院附属宝鸡医院消化内科，陕西 宝鸡 721006)

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种获得性代谢性肝病，可导致肝硬化、肝细胞癌、肝移植和死亡，是儿科常见的慢性肝病之一[1-2]。研究[3-4]表明，肥胖是引起NAFLD 的主要原因之一，肥胖儿童和青少年NAFLD患病率约为36.1%。NAFLD主要的临床特征为肝脏出现典型脂肪变性和炎症反应，肝脏单纯出现肝脂肪变性即可转换为NAFLD，最终导致肝硬化[5-6]。因此，治疗儿童NAFLD的关键是有效调控肝脏脂肪代谢及合成平衡，控制肝脏炎症反应。冬凌草甲素是由名为冬凌草的唇形科香茶菜属植物中分离得到一种二萜类化合物，研究[7-8]显示其具有抗炎、抗癌、神经保护等多种生物学功能。有研究[9]证实冬凌草甲素可以作为核因子E2相关因子2(Nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2)的激活剂和NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)抑制剂。Nrf2作为一种重要的核转录因子，显示出很强的抗氧化活性，已被广泛用作抑制氧化应激和由此产生的炎症的启动子[10]。随着氧化应激的发生，Nrf2进入细胞核内，启动抗氧化酶和抗氧化基因的转录，最终减轻氧化损伤[11]。但是关于冬凌草甲素对儿童NAFLD的作用及其机制尚未有相关报道，有待于进一步深入探究。因此，本研究通过高脂饲料构建幼龄大鼠NAFLD模型，明确冬凌草甲素对幼龄大鼠NAFLD的作用，并探究冬凌草甲素是否与Nrf2的激活及抑制肝脏氧化应激相关，为冬凌草甲素用于儿童NAFLD的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 3周龄SD大鼠56只，雌雄各半，由西安医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-2020-028。

1.2 主要试剂 冬凌草甲素(CAS：28957-04-2，质量分数≥98%)购自上海麦克林生化科技有限公司；HE染色试剂盒(批号：G1121)购自北京索莱宝科技有限公司；BCA试剂盒(批号：P0009-1)购自碧云天生物技术研究所；RIPA裂解液(批号：R0278-50ML)购自上海北诺生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：QN0463)购自北京百奥莱博科技有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号：BC0685)购自北京索莱宝科技有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(批号：FT-D23894)购自上海梵态生物科技有限公司；Nrf2(批号：K106685P)、核纤层蛋白B(Lamin B，批号：K200032M)、血红素氧合酶1(HO-1，批号：K106637P)和 醌氧化还原酶-1(NQO-1，批号：K106519P)一抗和山羊抗兔二抗(批号：SPA101)均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 NAFLD模型构建及分组：将56只3周龄SD大鼠随机分为对照组(13只)和高脂组(43只)。对照组采用普通饲料饲养，高脂组采用高脂饲料(基础饲料+10%猪油+2%胆固醇)饲养。6周后，分别在两组中随机抽取3只大鼠进行病理检查，用于评估NAFLD模型构建是否成功。NAFLD模型被构建成功后，将高脂组大鼠随机分成模型组、冬凌草甲素低剂量组(L组)、冬凌草甲素中剂量组(M组)和冬凌草甲素高剂量组(H组)，每组10只。冬凌草甲素低、中、高剂量组分别腹腔注射5、10、20 mg/kg[12]，1次/d，连续4周。4周后检测各组大鼠体重、空腹血糖、空腹血清胰岛素情况。随后处死大鼠，取血后迅速摘取肝脏，将肝脏组织均分为3份，放于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 血脂及肝功能指标检测：给药4周后，取各组大鼠血2 ml，4 ℃条件下3000 r/min离心15 min，分离血清后使用全自动生化分析仪测定大鼠血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。

1.3.3 氧化应激指标检测：取大鼠肝组织经研磨处理后制作组织匀浆，采用ELISA试剂盒检测各组大鼠肝脏组织中SOD、LDH、GSH-Px含量。

1.3.4 Western blot检测蛋白表达：各组大鼠肝脏组织利用RIPA裂解液裂解后，提取肝脏组织总蛋白，利用BCA试剂盒测定蛋白含量。采用SDS-PAGE电泳分离蛋白后，将蛋白质电转至PVDF膜。利用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h后，孵育一抗：适宜浓度的Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)和NQO-1(1∶1000)，并置于4 ℃下孵育过夜。第2天采用洗膜缓冲液(TBST)洗膜后孵育二抗：于室温下孵育1 h，继续采用TBST洗膜后即可显影观察蛋白情况。采用Image J软件，以GAPDH为内参，定量分析蛋白质条带灰度值。

1.3.5 肝组织HE染色：利用4%多聚甲醛于室温固定大鼠肝脏组织2 h，随后利用不同浓度的酒精进行脱水处理，利用二甲苯透明切片，将其浸入石蜡中包埋组织块，制作石蜡切片。随后进行HE染色，具体操作方法参照HE染色试剂盒说明书进行。最后用甘油明胶封片，镜下观察大鼠肝脏组织病理学变化。

1.3.6 肝组织油红O染色：首先利用4%多聚甲醛将肝组织固定，随后利用30%蔗糖溶液脱水，之后进行OCT包埋后切片，最后进行油红O染色，观察呈红色区域，用于评价肝细胞脂肪量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠体重、空腹血糖和血清胰岛素水平比较 见表1。模型组大鼠体重、空腹血糖和空腹血清胰岛素水平高于对照组(均P<0.05)。冬凌草甲素低剂量组大鼠各指标与模型组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。冬凌草甲素中剂量组和高剂量组大鼠体重、空腹血糖以及空腹血清胰岛素水平低于模型组(均P<0.05)。

表1 各组大鼠体重、空腹血糖和血清胰岛素水平比较

2.2 各组大鼠血脂及肝功能指标比较 见表2。模型组大鼠TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平高于对照组，HDL-C水平低于对照组(均P<0.05)。冬凌草甲素低剂量组大鼠各指标与模型组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。冬凌草甲素中剂量组和高剂量组大鼠TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平低于模型组，HDL-C水平高于模型组(均P<0.05)。

2.3 各组大鼠氧化应激指标比较 见表3。模型组大鼠SOD水平低于对照组，LDH和GSH-Px水平高于对照组(均P<0.05)。冬凌草甲素低剂量组大鼠各指标与模型组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。冬凌草甲素中剂量组和高剂量组大鼠SOD水平低于模型组，LDH和GSH-Px水平高于模型组(均P<0.05)。

2.4 各组大鼠肝组织Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达水平比较 见表4。模型组大鼠肝组织Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达水平低于对照组(均P<0.05)。冬凌草甲素低剂量组大鼠各指标水平与模型组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。冬凌草甲素中剂量组和高剂量组大鼠各指标水平高于模型组(均P<0.05)。

表2 各组大鼠血脂及肝功能指标比较

表3 各组大鼠氧化应激指标比较

表4 各组大鼠肝组织Nrf2、HO-1、

2.5 各组大鼠肝组织HE染色结果 见图1。正常组可观察到肝细胞排列整齐，肝小叶结构清晰，且无脂肪变性和炎细胞浸润。模型组大鼠肝细胞可观察到明显肿胀，细胞内可观察到大小不一的脂滴空泡，并且细胞核出现边缘化，同时组织中发生炎性细胞浸润，表明高脂饮食可诱导大鼠NAFLD。冬凌草甲素低剂量组与模型组相比略有改变，冬凌草甲素中剂量组和高剂量组可以观察到随着剂量增加脂肪变显著减轻，炎症细胞显著减少，提示冬凌草甲素可能会减轻高脂饮食诱导的NAFLD。

2.6 各组大鼠肝组织油红O染色结果 见图2。与对照组大鼠相比，模型组大鼠肝脏细胞中出现大量脂滴积聚现象，细胞内脂滴多为多囊泡型大泡，脂肪滴多呈片状分布。冬凌草甲素低剂量组并未显著缓解脂滴积聚现象。但在冬凌草甲素中剂量组和高剂量组，肝脏细胞中脂滴堆积情况有所减轻，证明冬凌草甲素干预后能够进一步减轻NAFLD大鼠肝细胞中脂滴堆积现象。

A：对照组；B：模型组；C：冬凌草甲素低剂量组；D：冬凌草甲素中剂量组；E：冬凌草甲素高剂量组

A：对照组；B：模型组；C：冬凌草甲素低剂量组；D：冬凌草甲素中剂量组；E：冬凌草甲素高剂量组

3 讨 论

NAFLD又称代谢性脂肪性肝炎，可进一步导致肝硬化甚至死亡[13]。NAFLD发病机制较为复杂，研究[14]显示其发生、发展是与脂质代谢紊乱和肝组织炎症反应显著相关的。因此，调控患者肝脏脂质代谢以及抑制肝组织炎症反应是缓解或治疗NAFLD的关键步骤。研究[15]显示，中药在治疗NAFLD方面具有一定疗效。冬凌草甲素是东亚地区常用中草药冬凌草的天然活性成分，具有多种药理和生物学特性，如抗炎、抗病毒和抗菌活性。

本研究利用高脂饮食诱导3周龄SD大鼠构建NAFLD大鼠模型，探究冬凌草甲素对幼龄NAFLD大鼠肝脏损伤的缓解作用，结果发现模型组大鼠体重、空腹血糖和血清胰岛素、TC、TG、LDL-C、ALT、AST均明显增加，并发生氧化应激反应。此外，利用HE染色观察大鼠肝组织，发现组织中肝细胞肿胀，并且细胞内出现大小不等的脂滴空泡，同时可见组织受到炎细胞浸润；同时，油红O染色观察到模型组大鼠肝细胞中出现大量脂滴积聚现象，细胞内脂滴多为多囊泡型大泡，脂肪滴多呈片状分布。以上结果表明，在本研究中利用高脂饮食可以成功诱导幼龄大鼠构建NAFLD模型。在此基础上我们展开研究，利用不同浓度冬凌草甲素干预NAFLD模型大鼠，并观察其对NAFLD大鼠体重、空腹血糖、空腹血清胰岛素、血脂水平、氧化应激相关指标、肝组织病理损伤、肝脏脂滴积聚以及肝组织中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达水平的影响。结果显示，低剂量冬凌草甲素对NAFLD的改善并不显著，但是中高剂量冬凌草甲素可以显著降低NAFLD大鼠体重、空腹血糖和空腹血清胰岛素水平，且呈剂量依赖性。研究[16]报道，脂代谢紊乱是NAFLD患者的病理现象之一，主要表现为血脂异常升高。因此，本研究检测了大鼠血脂含量，结果发现中高剂量冬凌草甲素可以显著降低NAFLD大鼠血脂水平，说明冬凌草甲素可以明显缓解NAFLD的临床症状。此外，HE染色和油红O染色观察到模型组大鼠肝细胞经过中高剂量冬凌草甲素干预后脂肪含量降低和炎症细胞减少，进一步证实了冬凌草甲素对NAFLD的改善功能。

氧化应激损伤是NAFLD发生、发展的重要因素之一[17]。在前期研究中我们发现，NAFLD模型大鼠肝组织发生氧化应激反应，为明确冬凌草甲素是否会对NAFLD大鼠肝组织中氧化应激反应起到抑制作用，本研究分别利用不同剂量冬凌草甲素对NAFLD模型大鼠进行干预，结果发现，冬凌草甲素中高剂量组均能够显著升高SOD水平，降低LDH和GSH-Px水平，证实冬凌草甲素可以缓解NAFLD大鼠的氧化应激反应。

Nrf2是一种作用于人类抗氧化反应元件上的转录因子，已有大量研究显示Nrf2对于肝脏具有保护作用，尤其是NAFLD发生后，会对肝脏损伤具有一定的改善作用。本研究发现模型组大鼠肝组织发生氧化应激后，Nrf2表达被显著下调，表明肝脏的抗氧化作用下降，肝损伤加重[18-19]。Nrf2发挥对肝脏的保护作用是通过调控相关抗氧化靶基因来实现的。HO-1是一种重要的抗氧化酶基因，可以维持细胞氧化和抗氧化的动态平衡。当细胞或组织发生氧化应激后，HO-1可以清除组织内过多的氧自由基，诱导抗氧化基因如SOD表达，后者可以促进氧自由基与氢离子结合生成过氧化氢，进而达到清除氧自由基的目的。NQO-1是一种具有调节细胞内氧化还原状态作用的黄素酶，当机体发生氧化应激时，Nrf2可以进入细胞核促进NQO-1的表达，进而起到抗氧化作用[20-21]。因此，为进一步明确冬凌草甲素对NAFLD的缓解作用是否通过激活Nrf2及下游抗氧化基因HO-1和NQO-1来实现的，本研究分别检测了经过不同剂量冬凌草甲素干预的NAFLD大鼠肝组织中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白的表达情况，结果发现，与模型组相比，冬凌草甲素中剂量组和高剂量组大鼠肝细胞中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白的表达水平被显著上调，证实冬凌草甲素对NAFLD肝损伤的改善作用是通过激活Nrf2、降低肝内氧化应激来实现的。

综上所述，冬凌草甲素通过激活Nrf2降低氧化应激水平，缓解高脂饮食诱导的幼龄大鼠NAFLD，为临证防治NAFLD提供了依据。