天竺葵素抑制肺癌进展的作用和机制研究

靳彩玲，姬颖华，王荦楠，杨军，张清琴，牛红蕊

（新乡医学院第一附属医院肿瘤科，河南新乡 453000）

肺癌是所有癌症中发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，是严重的世界公共卫生问题[1]。目前，肺癌的具体发病机制尚不完全清楚，抑制肺癌细胞恶性生长是肺癌治疗的主要研究方向。天竺葵素（pelargonidin，PEL）是天然的花青素单体，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等生理活性[2]。大量研究报道，不同来源的PEL 对肺癌、胃癌、肝癌等均有一定的抑制作用[3-5]。但PEL 在肺癌中的具体作用机制尚不完全清楚。本研究拟通过网络药理学分析PEL在肺癌中的潜在治疗靶点，并通过相关功能实验进行验证，旨在探讨PEL 治疗肺癌的分子机制，为其临床应用开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与实验动物来源 人肺癌细胞NCIH1975、NCI-H292 购自上海中科院细胞库；16 只BALB/c裸鼠，SPF级，雄性，6周龄，体质量16～20 g，购自河南省实验动物中心，生产许可证号：SCⅩK（豫）2017-0001。

1.1.2 药品 PEL 购自美国Sigma，质量分数＞98%，取3.07 mg PEL 溶于10 mL 无菌水中，配制为100 mmol/L 母液，再梯度稀释为10、20、25、40、50、80、100μmol/L的溶液。

1.1.3 试剂与仪器 干扰KIF11（shKIF11）慢病毒载体及杂序的短发卡RNA 阴性对照（shNC）、pcDNAKIF11 质粒及其阴性对照物（Vector）由北京阅微基因技术股份有限公司提供；脂质体2000 试剂盒（美国Invitrogen）；细胞计数（CCK-8）试剂（美国GLPBIO）；Transwell 小室、基质胶（美国BD）；正常山羊血清、生物素化山羊抗兔、细胞裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）；兔抗细胞增殖抗原Ki67、KIF11 抗体（美国Abcam）；iMARK 酶标仪（美国Bi-Rad）；CⅩ21BIM-SET5显微镜（日本OLYMPUS）。

1.2 PEL潜在靶点的预测和筛选

在PubChem 中获取PEL 的SMILES 号，并导入SwissTarget 和TargetNet 数据库，获取PEL 的预测作用靶点；下载TCGA_LUSC 数据矩阵，利用生信人工具采用t-检验统计学方法进行差异基因分析，筛选出在肺癌患者中表达上调的基因；下载TCGA_LUSC 临床信息，将肺癌患者分为临床分期I期和Ⅱ～Ⅳ期两组以及T1期和T2～T4期两组，进行差异基因分析，筛选出在临床分期Ⅱ～Ⅳ期/T2～T4期组中表达上调的基因。对PEL 潜在靶点、表达上调基因以及在临床分期Ⅱ～Ⅳ期/T2～T4 期组中高表达的基因取交集。进一步分析共同基因表达水平与淋巴结转移（N 分期）之间的关系，筛选出目标基因KIF11。

1.3 实验分组

（1）添加不同浓度PEL处理细胞（NCI-H1975：10、25、50、100 μmol/L，NCI-H292：10、20、40、80 μmol/L），并设置空白对照（Control，不含药物的培养基），观察PEL 对NCI-H1975、NCI-H292 细胞活性及KIF11表达的影响；（2）选取细胞生存率约50%的PEL 浓度（NCI-H1975：50 μmol/L、NCI-H292：40 μmol/L）为实验浓度处理细胞，并设置空白对照（Control），观察PEL对NCI-H1975、NCI-H292 细胞恶性生物学行为的影响；（3）构建肺癌裸鼠荷瘤模型，分为Control组和PEL 组，观察PEL 对裸鼠肿瘤生长的影响；（4）参照脂质体2000 试剂盒操作，以shKIF11 慢病毒载体及shNC 转染细胞，分为shNC 组、shKIF11 1#组和shKIF11 2#组，观察KIF11低表达对NCI-H1975、NCI-H292 细胞恶性生物学行为的影响；（5）以pcDNA-KIF11 质粒及Vector 转染细胞，分为Vector 组和KIF11 组，检测KIF11 蛋白的表达；（6）将细胞分为Contorl 组、PEL 组 和PEL+KIF11 组，观 察PEL、KIF11 对NCI-H1975、NCI-H292 细胞恶性生物学行为的影响。

1.4 CCK-8检测细胞活性

取各组细胞以1×105密度接种于96 孔板，分别培养1、2、3、4、5 d，隔天更换新鲜培养基，添加含有10%（φ）CCK-8试剂的培养基，继续培养4 h，于450 nm处检测各孔吸光度（A）值，以吸光度值表示细胞活性。

1.5 划痕实验检测细胞迁移

取各组细胞以1×106密度接种于6孔板，待细胞贴壁后，用200 μL 微量枪头垂直于孔底划痕，拍照记录0 h 划痕宽度，培养24 h，再次拍照记录24 h 划痕宽度。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭

预先用基质胶包被小室上室，取各组细胞以2×105密度接种于小室上室，下室添加含有10%（φ）胎牛血清培养基作为趋化物，培养48 h，取出小室轻轻拭去基质胶和上室内细胞，固定于冰甲醛溶液，结晶紫染色，显微镜下观察并计数侵袭细胞。

1.7 肺癌裸鼠荷瘤模型的建立

正常培养NCI-H1975 细胞，制备为5×106/L 细胞悬液，取0.2 mL 接种于裸鼠右腋部背侧皮下，接种5～10 d 后观察到接种部位可触及肿瘤结节表明建模成功。将荷瘤模型裸鼠分为两组：Control组和PEL 组，每组8 只，PEL 组隔天腹腔注射3 mg/kg PEL[6]，Control 组以等体积生理盐水替代，测量肿瘤长、短径，计算其体积，药物注射第14 天时处死裸鼠，剥取肿瘤组织，测量体积及质量后置于中性甲醛溶液中固定，制备石蜡切片。

1.8 免疫组化检测肿瘤组织中增殖抗原标记物Ki67的表达

取出肿瘤组织石蜡切片，经常规脱蜡水化后，滴加3%（φ）H2O2溶液灭活10 min，高温修复抗原15 min，分别添加正常山羊血清、Ki67 一抗（稀释比1∶100）、生物素化山羊抗兔（稀释比1∶500），终止反应后进行二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，脱水、透明后封片，显微镜下观察阳性染色细胞（棕黄色颗粒），利用Image-ProPlus 软件测定阳性细胞平均吸光度值（A）。

1.9 蛋白印迹检测细胞中KIF11表达

添加细胞裂解液提取各组细胞中总蛋白，测定浓度后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，待蛋白完全分离后停止电泳，冰上转膜，室温封闭2 h，加入一抗KIF11（稀释比1∶1 000），4 ℃下孵育过夜，再加入二抗（稀释比1∶5 000），37 ℃孵育1 h，最后化学发光显影。以β-肌动蛋白（β-actin）为内参，计算KIF11的相对表达量。

1.10 统计学方法

采用SPSS19.0 软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PEL潜在靶点的预测和筛选

如图1，韦恩分析结果显示，SwissTarget 数据库与TargetNet数据库预测PEL 的靶点，二者取并集得112 个靶点；下载TCGA_LUSC 数据矩阵和临床信息，对PEL 潜在靶点、表达上调基因以及在临床分期Ⅱ～Ⅳ期/T2～T4 期组中高表达的基因取交集，结果发现有KIF11和周期素依赖性激酶1（CDK1）2 个共同基因。进一步分析KIF11和CDK1基因表达水平与淋巴结转移之间的关系，结果表明N1 期组肺癌患者中KIF11表达水平更高（P＜0.05）。因此，KIF11作为目标基因进一步研究。

图1 PEL潜在靶点的预测和筛选Figure 1 Prediction and screening of PEL's potential targets

2.2 PEL对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

如图2，与Control组比较，10、25、50、100 μmol/L PEL 处理后NCI-H1975 细胞活性明显降低，10、20、40、80 μmol/L PEL 处理后NCI-H292 细胞活性明显降低（P＜0.05），50 μmol/L/40 μmol/L PEL 处理NCIH1975/NCI-H292 细胞后，细胞的存活率均在50%左右，因此选取50 μmol/L 和40 μmol/L PEL 干预NCI-H1975、NCI-H292 细胞做后续功能实验。与Control 组比较，PEL 组细胞活性、迁移能力及侵袭数明显降低（P＜0.05）。

图2 PEL对肺癌细胞恶性生物学行为的影响Figure 2 Effects of PEL on malignant biological behaviors of lung cancer cells

2.3 PEL对肺癌裸鼠荷瘤模型肿瘤生长的影响

如图3，与Control组比较，PEL组裸鼠肿瘤组织体积、质量及Ki67阳性表达明显降低（P＜0.05）。

图3 PEL对肺癌裸鼠荷瘤模型肿瘤生长的影响Figure 3 Effects of PEL on the growth of lung cancer in tumor-bearing nude mice models

2.4 PEL对肺癌细胞中KIF11表达的影响

如图4，与Control 组比较，10、25、50、100 μmol/L PEL 处理后NCI-H1975 细胞中KIF11表达明显降低，10、20、40、80 μmol/L PEL处理后NCI-H292细胞中KIF11表达明显降低（P＜0.05），呈剂量依赖性。50 μmol/L和40 μmol/L PEL分别处理NCI-H1975和NCI-H292 细胞12、24、48 h，NCI-H1975、NCI-H292细胞中KIF11表达明显降低（P＜0.05），呈时间依赖性。

图4 PEL对肺癌细胞中KIF11表达的影响Figure 4 Effects of PEL on the expression of KIF11 in lung cancer cells

2.5 低表达KIF11 对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

如图5，与shNC组比较，shKIF11 1#组和shKIF11 2#组KIF11表达、细胞活性、迁移能力及侵袭数明显降低（P＜0.05）。

图5 低表达KIF11对肺癌细胞恶性生物学行为的影响Figure 5 Effects of low-expression KIF11 on malignant biological behaviors of lung cancer cells

2.6 PEL 靶向KIF11 对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

如图6，与Vector 组比较，KIF11 组KIF11表达明显升高（P＜0.05）；与PEL 组比较，PEL+KIF11 组KIF11表达、细胞活性、迁移能力及侵袭数明显升高（P＜0.05）。

图6 PEL靶向KIF11对肺癌细胞恶性生物学行为的影响Figure 6 Effects of PEL on the malignant biological behaviors of lung cancer cells by targeting KIF11

3 讨论

近年来，植物天然产物在阻止、逆转或延缓癌症进展方面有重要作用，已成为肿瘤学领域的研究热点[7]。研究表明，食用富含类黄酮的食物可能降低癌症风险[8]。黄酮类化合物是植物中常见的一类次生代谢产物，可存在于植物叶子、花、种子、茎等多个部位，具有丰富的生物活性，如抗癌、抗氧化、抗病毒等[9-10]。PEL 是一种类黄酮前体化合物合成的花青素，也表现出一定的抗癌活性[11]。Chen 等[12]研究发现，PEL 对骨肉瘤细胞U2OS 有明显的抑制作用，可能与阻滞PI3K/AKT 信号通路有关。本研究通过检测细胞恶性生物学行为能力，发现PEL 可抑制肺癌细胞NCI-H1975、NCI-H292 的增殖、迁移及侵袭能力，同时构建肺癌裸鼠荷瘤模型，通过肿瘤生长曲线、体积、质量及肿瘤组织中增殖抗原标记物Ki67的表达，结果显示PEL在体内也表现出明显的抗肿瘤活性。但PEL 抗肺癌的具体分子机制尚不清楚。

本研究应用网络药理学分析PEL 的潜在靶点，初步筛选出112 个靶点，进一步下载TCGA_LUSC数据矩阵和临床信息，最终确定KIF11为靶基因进行后续验证实验。驱动蛋白超家族（KIFs）是调控细胞内转运的一类蛋白，不仅可控制细胞形态，还在高级生物功能中有重要作用[13]。近期报道结果显示，KIFs 还参与人类癌症的发生发展[14]。KIF11作为成员之一，主要参与纺锤体的形成及其动力学的维持，在多种癌症中存在异常表达[15]。Zhou 等[16]利用生物信息学软件筛查乳腺癌中差异表达基因，发现KIF11可能是乳腺癌发生发展的潜在致癌基因，与其不良预后密切相关。Yang 等[17]研究发现，KIF11、KIF4A、FOXM1等基因在卵巢癌中异常表达，与疾病进展有关，可用于治疗卵巢癌潜在靶向药物的开发。李蓉等[18]研究显示，非小细胞肺癌中KIF11高表达，对于患者临床诊治和预后预测有较好前景。本研究结果显示，KIF11在肺癌组织中异常高表达，且与患者临床分期、T 分期及N 分期等临床病理特征有关，提示KIF11高表达可能参与肺癌的发生发展。敲低KIF11表达后，肺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力明显降低，证实KIF11在肺癌中发挥促癌因子作用。Hu[19]、Li[20]等基础研究结果也显示，KIF11可促进肝癌、肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭。另外，PEL 处理细胞后，KIF11表达明显降低，增强细胞中KIF11表达后，可逆转PEL 对肺癌细胞的抑制作用，表明PEL 抑制肺癌细胞增殖、迁移与侵袭，是通过靶向抑制KIF11表达实现的。

综上所述，PEL可抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，其作用机制可能与靶向抑制KIF11表达有关。但PEL 在肺癌中是否还存在其他作用途径，仍需要深入分析和研究。