穿心莲酸对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠主动脉病理及炎症小体NLRP3通路的影响

赖亦静 ，黄雪君，2，3 ，李钰婷 ，彭莎 ，江洁怡，2，3 ，陈玉兴，2，3，蔡大可，2，3，甘海宁，2，3

[1.广州中医药大学第五临床医学院，广东广州 510095；2.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东广州 510095；3.广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州510095]

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心血管病的基础性病变，可引起缺血性心脏病、中风和外周血管疾病等心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）。CVD是发达国家的主要死亡原因[1]，而在发展中国家与CVD有关的死亡人数也在不断增加。AS在2种最常见的CVD——心脏缺血和脑血管疾病[2]的发病机制中起着预先决定作用，因此阻止AS的发生与进展已成为心血管疾病防治的研究重点。20世纪以来，脂质积累被认为在AS发展中起主导作用，1999年Ross提出AS是一种慢性炎症反应[3]，炎症是AS发生发展过程中的重要推动力，越来越多的研究证明炎症因子和炎症小体在AS的炎症反应中起着关键作用，其中以NLRP3（NOD-，LRR-，and PYD-containing protein 3）为代表的炎性小体备受关注。NLRP3炎症小体是一种细胞内模式识别受体，当配体与NLRP3结合后促进炎症小体的形成，并对caspase-1 进行自身激活，最终导致白介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）和白介素-18（interleukin-18，IL-18）的成熟及分泌[4]，参与AS 的炎症反应过程。课题组前期研究表明，穿心莲内酯有减轻AS 炎症反应、减缓主动脉斑块形成的作用[5]。但穿心莲内酯溶解性低，生物利用度低，课题组在对穿心莲内酯结构修饰研究中发现其五元环内酯开环物穿心莲酸的抗炎活性与穿心莲内酯相当[6]，并能明显影响caspase的表达[7]。本研究将基于NLRP3通路探讨穿心莲酸干预AS发生发展的作用，为AS的防治药物研发提供实验依据。

1 材料

1.1 药物与试剂

瑞舒伐他汀钙片（rosuvastatin），阿斯利康药业（中国）有限公司，批号： 134454；穿心莲酸（andrographolic acid），广东省中医药工程技术研究院制备[7]。小鼠高脂饲料含76.5%标准饲料、0.5%胆酸钠、5%蔗糖、3%胆固醇、10%猪油、5%蛋黄粉，购自广东省医学实验动物中心。NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 抗体，购自美国Proteintech。胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、三酰甘油（triglyceride，TG）试剂盒、低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物

SPF 级ApoE-/-小鼠50 只，C57BL/6 小鼠10 只，雄性，5～6 周龄，体质量（22±2）g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号SCⅩK（粤）2018-0002。

1.3 主要仪器

BS224S 电子天平（1/万）（德国SARTORIUS）；5418 型小型高速冷冻离心机（德国Eppendorf）；Varioskan Flash 型全波长多功能酶标仪（美国Thermo）；SmartSpec plus 核酸蛋白测定仪、miniprotean Teral Cell 垂直电泳槽、PowerPac Basic 电泳仪（美国Bio-Rad）；5200 Multi 多功能成像系统（上海Tanon）；BⅩ51显微镜（日本Olympus）。

2 方法

2.1 动物分组与造模

ApoE-/-小鼠适应性喂养1周后每笼小鼠每天定量给予高脂饲料20 g，连续8 周，C57BL/6 小鼠作为野生型对照组小鼠给予普通配合饲料。第8 周末，小鼠眼眶静脉丛采血，按TC 水平将进食高脂饲料小鼠随机分为5 组，每组10 只，分别为模型组、瑞舒伐他汀组、穿心莲酸高、中、低剂量组。瑞舒伐他汀片临床每日口服1 粒，相当于10 mg 瑞舒伐他汀，根据体表面积换算[8]小鼠等效剂量为1.3 mg/kg。根据前期实验结果设置穿心莲酸高、中、低剂量分别为25、12.5、6.25 mg/kg。

2.2 动物给药及取材

从第8 周开始，各给药组给予相对应药物灌胃20 mL/kg，正常对照组和模型组给予等容量蒸馏水灌胃，每天1 次，连续8 周。末次给药前12 h 禁食不禁水。末次给药后1 h，小鼠眼眶静脉丛取血，3 000 r/min离心10 min取血清，置于-80 ℃冰箱保存；取部分主动脉置于中性甲醛溶液固定，取另一部分主动脉置于液氮速冻后-80 ℃保存。

2.3 检测指标

2.3.1 血脂水平 根据试剂盒说明书，检测血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.3.2 主动脉病理形态检测 将中性甲醛溶液固定的主动脉，按照常规方法制作石蜡切片，进行油红O染色。染色前将切片在室温下放置20 min，待载玻片上水汽消失后，油红O 染液染色8 min，85%异丙醇洗15 s，蒸馏水洗1 min。苏木精染色5 min，蒸馏水洗2 min，用水溶性封片剂封片，显微镜观察主动脉斑块变化。

2.3.3 Westernblot蛋白免疫印迹分析NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 的表达 将RIPA 裂解液与PMSF、蛋白酶/磷酸酶抑制剂按照100∶1∶1（体积比）配制成浓度为含1%PMSF 及蛋白酶/磷酸酶抑制剂的组织裂解液，置于冰上预冷，现配现用。取出-80 ℃冰箱保存的小鼠主动脉，加入1 mL 组织裂解液，用电动匀浆器在冰上充分研磨后，放置10 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min。吸取上清液，弃去沉淀，按照BCA蛋白定量检测试剂盒的方法，测定各样品A值，计算每个样品蛋白浓度。吸取调整后的蛋白样品80 μL，加入20 μL 的5×上样缓冲液，充分混匀后，100 ℃加热5 min，使蛋白质充分变性。提取的蛋白经电泳、转膜、封闭后，加入相应的一抗，4 ℃环境中孵育过夜后将膜取出，吸去一抗，洗涤3 次后加入相应的二抗，室温摇床孵育90 min，80 r/min，吸去二抗，洗涤3 次后将PVDF 膜保存在PBST 洗涤液中，在暗室中将PVDF膜置于ECL发光显影液中1～2 min，使用凝胶自动成像系统对PVDF 膜进行拍摄，并用Image J软件对蛋白条带灰度进行半定量分析，计算各组目的蛋白表达水平。

2.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件，计量资料以表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，先行Levene Statistic 方差齐性检验。方差齐时，采用SNK 检验进行组间均值两两比较；方差不齐时，采用Dunnett T3检验进行组间均值两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 穿心莲酸对AS小鼠血脂水平的影响

与正常对照组比较，模型组TC、TG、LDL-C含量显著性升高（P＜0.01），HDL-C 含量显著性降低（P＜0.05）；与模型组比较，瑞舒伐他汀组和穿心莲酸高、中、低剂量组TC 含量显著性降低（P＜0.05），HDL-C含量显著性升高（P＜0.05），瑞舒伐他汀组和穿心莲酸高、中剂量组LDL-C 含量显著性降低（P＜0.05），各给药组TG 含量与模型组比较差异无统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C含量Table 1 Level of Serum TC,TG,LDL-C,HDL-C in different groups(,n=10)c/(mmol·L-1)

表1 各组小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C含量Table 1 Level of Serum TC,TG,LDL-C,HDL-C in different groups(,n=10)c/(mmol·L-1)

与正常对照组比较：**P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05。

3.2 穿心莲酸对AS小鼠主动脉病理学的影响

正常对照组小鼠主动脉壁厚薄均匀，主动脉内膜光滑平整，内膜各层结构正常，未发现明显的动脉粥样硬化病灶。模型组可见动脉管腔不平，管腔内膜增厚，斑块明显红染，脂质浸润斑块增多明显；瑞舒伐他汀组、穿心莲酸高剂量组的主动脉壁各层结构正常，局部可见较小斑块，病变程度明显较轻；穿心莲酸中、低剂量组的主动脉壁增厚，脂质浸润斑块明显较多。见图1。

图1 各组小鼠主动脉病理学形态观察（油红O染色，40×）Figure 1 Histopathological changes in the aorta of mice in different groups(Oil red staining,40×)

3.3 穿心莲酸对AS 小鼠主动脉NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18表达的影响

与正常对照组比较，模型组caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表达量显著性升高（P＜0.05），NLRP3 蛋白表达量有升高趋势但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，穿心莲酸高、中、低剂量组NLRP3、caspase-1蛋白表达量显著性降低（P＜0.05），穿心莲酸高、中剂量组IL-1β、IL-18 蛋白表达量显著性降低（P＜0.05），瑞舒伐他汀组caspase-1 蛋白表达量显著性降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组小鼠主动脉NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达Figure 2 Protein expressions of NLRP3,caspase-1,IL-1β and IL-18 in the aorta of mice from each group(,n=3)

4 讨论

高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠建立AS 模型，脂质代谢出现紊乱，脂质在主动脉内膜下沉积并伴随内膜增厚，发生炎性浸润等。在本实验中，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平显著升高，HDL-C 水平显著降低，胸主动脉病理切片油红O 染色显示主动脉壁粗糙，内膜明显增厚，斑块增多，脂质明显浸润。穿心莲酸干预后，血脂水平明显改善，主动脉病变得到不同程度改善，穿心莲酸高中低剂量血清TC 及LDL-C 水平显著下降，HDL-C 水平显著升高，穿心莲酸高剂量组主动脉壁各层正常，斑块较少，脂质浸润明显减轻，与瑞舒伐他汀组相近，表明穿心莲酸可改善血脂水平，减轻AS小鼠主动脉病变。

脂质沉积和炎症反应是动脉粥样硬化的2个主要特征，两者相互作用、互为因果共同构成了AS 的基本发病机制。AS 相关病变中并不存在微生物感染，其无菌炎症主要是由炎症小体活化。NLRP3炎症小体是一种细胞内模式识别受体，当配体与NLRP3结合后促进炎症小体的形成，NLRP3的配体主要是内源性的，胆固醇、脂蛋白、细胞坏死成分等都可以激活NLRP3炎症小体在非感染情况下引发和维持慢性炎症反应[9]。在动脉粥样硬化发展的过程中，胆固醇是炎症小体通路的重要激活剂，在疾病早期就发挥重要作用，胆固醇结晶可以通过激活巨噬细胞内的NLRP3 炎症小体参与AS 的早期形成，其依赖于caspase-1 的激活促成IL-1β的释放[10]。当配体与NLRP3蛋白的LRR 结构域结合后NLRP3被活化，暴露PYD，再通过PYD-PYD 相互作用与其接头蛋白ASC 结合，由ASC 的CARD 结构域招募procaspase-1，形成炎症小体，并对caspase-1进行自身激活，活化后的caspase-1 对pro-IL-1 和pro-IL-18 等底物进行切割，促进IL-1β和IL-18的成熟及分泌[11]。

大量研究证明了NLRP3炎性小体在人类心血管疾病中的突出作用，冠状动脉粥样硬化患者在大动脉的NLRP3表达比无症状斑块患者显著增加，NLRP3炎性小体信号通路包括NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18在大动脉中表达显著增强，这与疾病严重程度及CVD 的危险因素有关[12-14]。有研究发现丹参酮ⅡA显著降低体内及体外模型的NLRP3炎性小体的启动和激活，从而改善了AS的病变程度[15]。本实验结果显示，AS模型小鼠胸主动脉NLRP3炎症小体蛋白表达有升高趋势，穿心莲酸各剂量组可有效降低NLRP3炎症小体表达。模型组NLRP3蛋白表达水平虽有升高，但差异无显著性可能与不同动物模型有关，也可能受激活NLRP3的其他通路的影响[16]。

在动脉粥样硬化斑块中caspase-1的活化标志着炎症小体的活化。caspase-1是主要的IL-1处理蛋白酶，作为酶原大量存在于造血细胞中，需要炎症小体的激活。IL-1β前体pro-IL-1β没有生物活性，需要caspase-1进行蛋白水解，导致IL-1β活性细胞因子的分泌。IL-1β是参与炎症反应的重要细胞因子，不仅自身参与急慢性炎症反应，更能诱发其下游多种炎症介质的释放，从而在动脉硬化发生发展的炎症反应过程中发挥重要作用[17-18]。最近Canakinumab抗炎性血栓形成结果研究（CANTOS）[19]结果显示，针对IL-1β通路的抗炎治疗显著降低了心血管事件的复发率，此外以IL-1β抑制为例的进一步研究强调了抗炎药物潜在的治疗价值[20]。人体动脉粥样硬化斑块，尤其是斑块巨噬细胞中高表达IL-18，并且IL-18 水平升高与动脉粥样硬化斑块的不稳定性相关[21]，IL-18 缺陷能使ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化有所改善[22]。本实验结果显示，AS模型小鼠胸主动脉caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表达水平显著升高，穿心莲酸高、中剂量组均可有效地降低caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达。以上结果表明穿心莲酸可能通过NLRP3炎症小体相关通路，降低AS 模型主动脉NLRP3、caspase-1、IL-1β及IL-18的表达水平，减轻炎症对AS的影响。

综上所述，本研究表明穿心莲酸可以调节ApoE-/-小鼠AS 模型的血脂水平，改善主动脉病变及脂质沉积，下调主动脉NLRP3、caspase-1、IL-1β及IL-18 表达，减轻炎症反应，发挥明显抗AS 作用，调控NLRP3炎症小体可能是穿心莲酸发挥抗AS作用机制之一。