微小RNA-218-5p靶向Jagged 1调控人牙周膜干细胞的活性和骨向分化

马文贤，黄琼，董振耀

微小RNA（miRNA）为长度在19～23个核苷酸之间的短链非编码微小RNA，其在多种疾病中均具有调控功能，其中包括牙周炎。微小RNA-218-5p（miR-218-5p）在牙周炎中的作用虽然已得到部分学者的肯定，但其调控机制与Notch 信号通路的关系尚未清楚。Notch 信号通路在维持细胞生长、分化方面具有关键作用，其在疾病的进程中具有重要作用。Notch 信号通路通过Notch 蛋白与相邻细胞上的配体Jagged 1（JAG1）蛋白结合而被激活，Notch蛋白的裂解在细胞内发生，导致Notch 细胞内结构域易位到细胞核中并进一步调节Notch 靶基因表达。Notch 信号通路参与成骨分化过程和破骨细胞生成的诱导过程。但是miR-218-5p 与JAG1 在人牙周膜干细胞（hPDLSCs）中的作用关系尚不清楚。2018年12月至2019年9月，本研究拟以人牙周膜干细胞hPDLSCs 为研究对象，观察抑制miR-218-5p、过表达JAG1 对hPDLSCs 细胞活性、分化的影响，揭示其机制，为牙周膜干细胞治疗牙周炎，促进牙周骨组织再生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

hPDLSCs 购自ATCC；兔抗人JAG1、Ⅰ型胶原蛋白（Col-1）、骨钙素、Runt 相关转录因子2（Runx2）多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗体均购自Santa Cruz；pcDNA 3.1 载体购自康为世纪；α-MEM 培养基购自Hyclone 公司；胎牛血清均购自Gibco 公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒购自美国GIBCO 公司；转染试剂Lipofectamine2000 购自北京索莱宝科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自上海源叶生物公司；逆转录试剂盒购自大连Takara 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自德国罗氏诊断有限公司；ECL发光液购自北京普利莱基因技术有限公司；RIPA裂解液购自碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega 公司。实验中所有引物的合成及序列均由上海吉玛公司合成。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养 用含10 %胎牛血清的α-MEM 培养基培养人牙周膜干细胞hPDLSCs，置于37 ℃，5%二氧化碳的培养箱中常规培养。

1.2.2

细胞转染 将未做任何处理的hPDLSCs 细胞标记为对照组；anti-miR-218-5p、anti-miR-NC、pcDNA、pcDNA-JAG1、anti-miR-218-5p+si-NC、antimiR-218-5p+si-JAG1 按照脂质体Lipofectamine2000 说明书操作步骤要求转染至正常培养的hPDLSCs 细胞，分别标记为anti-miR-218-5p 组、antimiR-NC 组、pcDNA 组、pcDNA-JAG1 组、anti-miR-218-5p+si-NC 组、anti-miR-218-5p+si-JAG1 组，转染48 h后，用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测转染效率。转染成功后，用于后续试验。

1.2.3

qRT-PCR 检测细胞中miR-218-5p、Col-1、骨钙素、Runx-2 的表达 为了观察miR-218-5p、JAG1 对hPDLSCs 细胞中Col-1、骨钙素、Runx-2 的mRNA 表达的调控，本探究通过抑制miR-218-5p、过表达JAG1、敲减JAG1 检测其中Col-1、骨钙素、Runx-2 的mRNA 表达情况。将对照组、anti-miR-218-5p 组、anti-miR-NC 组、pcDNA 组、pcDNA-JAG1组、anti-miR-218-5p+si-NC 组、anti-miR-218-5p+si-JAG1 组细胞，遵照RNA 抽提试剂盒说明书要求操作提取RNA，进行定量，然后按逆转录试剂盒按照说明书操作合成互补DNA（cDNA），相关序列信息见表1。最后按qRT-PCR 试剂盒说明书操作进行miR-218-5p、Col-1、骨钙素、Runx-2 检测。用2计算miR-218-5p、Col-1、骨钙素、Runx-2的表达。

表1 相关序列信息

1.2.4

MTT 法检测细胞活性 调整对照组、antimiR-218-5p 组、anti-miR-NC 组、pcDNA 组、pcDNAJAG1 组、anti-miR-218-5p+si-NC 组、anti-miR-218-5p+si-JAG1 组细胞密度至10/mL，取200 μL，加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，培养4 h，然后弃去上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），震荡，使结晶溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度。

1.2.5

茜素红染色实验 将对照组、anti-miR-218-5p 组、anti-miR-NC 组hPDLSCs 细胞调整至10/mL，然后接种在6 孔板中进行常规培养，弃去未贴壁的细胞和培养液，用10 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β甘油酸钠及50 mg/L 维生素C 的α-MEM 成骨诱导液或者10 μg/L转化生长因子β1（TGF-β1）的α-MEM成骨诱导液处理hPDLSCs。每2～3天换液，分别培养14 d、21 d、28 d，在倒置显微镜下观察矿化结节的形成。

1.2.6

蛋白质印迹法（Westrn blotting）实验检测细胞中JAG1、Col-1、骨钙素、Runx-2 的蛋白表达 收集对照组、anti-miR-218-5p 组、anti-miR-NC 组、pcDNA 组、pcDNA-JAG1 组、anti-miR-218-5p+si-NC 组、anti-miR-218-5p+si-JAG1 组细胞，调整细胞密度至10/mL，加入裂解液，冰上裂解30 min。12000 r/min离心10 min。取上清置于离心管，加入5×SDS 上样缓冲液，沸水煮沸10 min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF 膜；5 %脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入Ⅰ抗（1∶500 倍稀释的兔抗人JAG1、Col-1、骨钙素、Runx-2 多克隆抗体），4 ℃过夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗（1∶1000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG），4 ℃，2 h。加发光液，曝光。

1.2.7

双荧光素酶报告基因检测实验 将目的基因JAG1-WT 和JAG1-MUT 进行XhoⅠ和NotⅠ酶切，并回收目的片段，克隆至PUC-T 载体。再将目的序列与psiCHECK-2 载体链接，点击法插入DH5α 感受态细胞，再用500 μL LB 液体培养基进行摇菌和优势菌落挑选，扩大优势菌落培养，最后提取质粒DNA。用脂质体法将psiCHECK2-JAG1-3′非翻译区（UTR）WT、psiCHECK2-JAG1-3′UTR MUT 转染至对照组、miR-218-5p 组、miR-NC 组细胞。最后按双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册要求操作。psiCHECK2 载体以萤火虫荧光素酶活性为内参，psiCHECK2-JAG1-3′UTR WT 和psiCHECK2-JAG1-3′UTR MUT 的表达为对照，检测荧光强度。海肾荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值反映miR-218-5p与JAG1的结合力。

2 结果

2.1 抑制miR-218-5p 表达对hPDLSCs 活性的影响

与anti-miR-NC 组相比，anti-miR-218-5p 组hPDLSCs 细胞中miR-218-5p 表达显著降低（

P

＜0.001），48、72 h时，细胞活性显著升高（均

P

＜0.001）。见表2。

表2 抑制miR-218-5p表达对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）活细胞数的影响/±s

2.2 抑制miR-218-5p 表达对hPDLSCs 骨向分化的影响

与anti-miR-NC 组相比，anti-miR-218-5p 组hPDLSCs 细胞的矿化结节明显升高，Col-1、骨钙素、Runx-2 的mRNA 和蛋白的相对表达量均显著升高（均

P

＜0.001）。见图1、图2、表3。

图1 抑制miR-218-5p表达观察人牙周膜干细胞（hPDLSCs）骨向分化时矿化结节的形成（茜素红染色×100）

图2 蛋白质印迹法检测抑制miR-218-5p表达后人牙周膜干细胞（hPDLSCs）骨向分化时Col-1、骨钙素、Runx-2蛋白电泳图

表3 抑制miR-218-5p表达对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）骨向分化的影响/±s

2.3 JAG1 过表达对hPDLSCs 活性和骨向分化的影响

与pcDNA 组相比，pcDNA-JAG1 组hPDLSCs细胞中JAG1 蛋白表达显著升高（

P

＜0.001），48、72 h时，细胞活性显著升高（均

P

＜0.001），Col-1、骨钙素、Runx-2 的mRNA 的相对表达量和蛋白表达量均显著升高（均

P

＜0.001）。见表4。

表4 JAG1过表达对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）活性和骨向分化的影响/±s

2.4 miR-218-5p 靶向调控JAG1 的表达

运用miRcode 数据库预测到miR-218-5p 与JAG13′UTR存在结合位点（图3）；双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-NC 组相比，miR-218-5p 组WT-JAG1 细胞中荧光活性显著降低（

P

＜0.001），MUT-JAG1 细胞中荧光活性不受影响（

P

=0.308），见表5。对照组、miR-NC 组、miR-218-5p 组、anti-miR-NC 组及antimiR-218-5p 组细胞中JAG1 蛋白相对表达量分别为（0.45±0.04）、（0.52±0.05）、（0.21±0.03）、（0.49±0.04）及（0.84±0.08）（

F

=175.396，

P

＜0.001）；与miR-NC 组相比，miR-218-5p 组JAG1 蛋白相对表达显著降低（

P

＜0.001），与anti-miR-NC 组相比，anti-miR-218-5p组JAG1蛋白相对表达显著升高（

P

＜0.001）。

图3 Jagged-1（JAG1）的3’非翻译区（UTR）中含有与miR-218-5p互补的核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验/±s

2.5 抑制JAG1 表达逆转了抑制miR-218-5p 表达对hPDLSCs 活性骨向分化的作用

结果如图4 和表6所示，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-218-5p组hPDLSCs 细胞中JAG1 蛋白表达显著升高（

P

＜0.001），48、72 h 时，活细胞数显著升高（均

P

＜0.001），Col-1、骨钙素、Runx-2 的mRNA 和蛋白的相对表达量均显著升高（均

P

＜0.001）；与anti-miR-218-5p +si-NC 组 相比，anti-miR-218-5p +si-JAG1 组hPDLSCs 细胞中JAG1 蛋白表达显著降低（

P

＜0.001），48、72 h 时，细胞增殖显著降低（均

P

＜0.001），Col-1、骨钙素、Runx-2 的mRNA 和蛋白的相对表达量均显著降低（均

P

＜0.001）。

表6 抑制JAG1表达逆转了抑制miR-218-5p表达对人牙周膜干细胞（hPDLSCs）增殖骨向分化的作用/±s

图4 蛋白质印迹法检测人牙周膜干细胞（hPDLSCs）JAG1、Col-1、OCN、Runx-2蛋白电泳图

3 讨论

miRNA 在人类各种疾病的发生发展中均具有调节作用，其中包括牙周组织流失。Hao 等使用微阵列分析成骨分化期间的miRNA 表达谱发现，miR-218-5p 是其中差异表达的miRNA 之一。李建嘉等通过诱导hPDLSCs 发生成骨分化，检测其中miR-218-5p 及成骨相关基因的表达发现，诱导分化后miR-218-5p 表达下调，miR-218-5p 在hPDLSCs 成骨分化过程中可能起负调控作用。最近Guo等在研究中发现，miR-218 的过度表达可以抑制Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白和牙本质唾液蛋白（DSP）的降解，抑制破骨细胞的形成，并抑制促炎细胞因子的分泌，其机制与靶向基质金属蛋白酶9（MMP9）相关。Zhong 等研究发现，LncRNA CCAT1 通过负调控miR-218 促进牙周膜细胞细胞增殖和分化。本研究运用MTT、qRT-PCR 法检测了抑制miR-218-5p 的hPDLSCs 细胞的活性和成骨相关基因Col-1、骨钙素、Runx-2 的表达发现，细胞活性显著增强，成骨相关基因Col-1、骨钙素、Runx-2的表达水平明显上调，说明抑制miR-218-5p 具有促进hPDLSCs 细胞成骨分化的功能，提示miR-218-5p 具有促进人牙周膜干细胞分化的潜力。而Guo等在牙周炎的研究中支持过表达miR-218能够通过减轻牙周炎病人的骨吸收和炎症达到保护作用，这说明miR-218-5p 在牙周膜干细胞中的功能与在牙周炎病人中的功能存在差异，但本课题组并没有在实验动物体内进行验证，这也为临床试验提供参考。深入研究，通过生物信息学、双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-218-5p 与JAG1 存在靶向负调控的关系，这为miR-218-5p在成骨分化中的作用机制研究奠定基础。

JAG1 和Notch1 是Notch 信号通路的关键基因，该通路是细胞间发生作用的重要机制，近几年其在成骨分化中的功能成为研究的热点。袁萍等报道，在牙周炎病人牙周膜干细胞中Notch 信号通路受到抑制，而在轻微牙周炎症病人中，激活Notch信号通路有助于病人缺损牙槽骨的成骨分化。张文等研究发现，在hPDLSCs 细胞不发生增殖的情况下，成骨相关基因及Notch 信号通路的配体表达发生上调。最近，马玉等研究显示，在PDLSCs 发生增殖时，成骨标志基因的表达量发生下调，Notch信号通路相关分子JAG1 发生下调，提示Notch 信号通路可调控PDLSCs 的骨向分化能力。本研究发现，过表达JAG1 可增强细胞的活性，促进成骨相关基因Col-1、骨钙素、Runx-2 的表达，可见，过表达JAG1具有促进hPDLSCs细胞发生骨向分化的功能，这与前人的激活Notch 信号通路可治疗牙周炎牙槽缺损的实验结果相一致，这是首次在体外验证Notch 信号通路关键基因JAG1 具有促进hPDLSCs细胞骨向分化的功能。深入研究发现，抑制JAG1表达可逆转抑制miR-218-5p 对hPDLSCs 的活性和骨向分化作用。

综上所述，抑制miR-218-5p 可促进人牙周膜干细胞发生成骨分化，其作用机制与靶向JAG1 相关，为牙周膜干细胞用于治疗人牙周疾病奠定理论基础。

（本文图1见插图12-3）